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基因重组真菌免疫调节蛋白的筛选与功能检测

作　者: 王雪飞
导　师: 周选围
学　校: 上海交通大学
专　业: 植物学
关键词: 真菌免疫调节蛋白菌落杂交筛选改组模式相对表达水平血细胞凝集细胞因子
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 46次
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内容摘要

真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory proteins,FIPs)是从高等担子菌中分离出来的一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质,目前已经从多种高等担子菌中分离得到天然蛋白质以及克隆得到fip基因序列,真菌免疫调节蛋白具有广泛的免疫调节特性,如促进淋巴细胞的增殖,调控细胞周期,诱发细胞凋亡,影响细胞因子的表达,活化细胞粘附分子,抗过敏反应等等,具有巨大的蛋白质药物研究开发潜力。本实验将fip基因根据其来源分成两组:属内组(fip-glu和fip-gsi)和属间组(fip-glu、fip-fve和fip-vvo),利用DNA shuffling技术对这两组基因在分子水平上进行重组,构建得到改组文库,利用斑点杂交技术和特异性抗体对改组文库共筛选426株属内重组菌株和412株属间组菌株。经过序列分析和蛋白诱导表达分析,属内组和属间组基因重组蛋白完全符合改组模式,检测重组蛋白的相对表达产量并筛选得到相对表达产量明显提高的菌株;纯化蛋白并进行血细胞凝集实验以及小鼠脾细胞因子诱导表达分析,实验证明当属内组FIP和属间组FIP的浓度不低于0.20μg ml-1和1.56μg ml-1时,能够凝集小鼠血细胞;重组FIP能够诱导小鼠脾细胞因子interleukin(IL)-2, IL-3, IL-4, interferon(IFN)-γ, IL-2 receptor(IL-2R)和lymphotoxin(LT)基因的转录水平。该项研究使利用基因工程和发酵技术进行目的产物的产业化生产将逐渐成为可能,同时有助于探索该蛋白质家族编码基因的表达调控关系。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
图表目录  13-15
符号说明  15-18
第一章绪论  18-42
  1.1 蕈菌的生物活性概述  18-19
  1.2 真菌免疫调节蛋白（FIPs）概述  19-25
    1.2.1 基因与蛋白结构  19-22
    1.2.2 FIPs 的氨基酸组成与结构特征  22-25
  1.3 真菌免疫调节蛋白（FIPs）的表达  25-28
    1.3.1 在原核细胞表达系统中的表达  25-26
    1.3.2 在真核细胞表达系统中的表达  26-27
    1.3.3 其它动植物细胞中的表达  27-28
  1.4 真菌免疫调节蛋白（FIPs）与免疫调节相关的功能  28-37
    1.4.1 促进淋巴细胞的增殖  30-31
    1.4.2 调控细胞周期，诱发细胞凋亡  31-32
    1.4.3 影响细胞因子的表达  32-33
    1.4.4 活化细胞粘附分子  33-34
    1.4.5 抗过敏反应  34-35
    1.4.6 调控免疫效应细胞  35-37
  1.5 分子定向进化技术的发展  37-39
    1.5.1 DNA 改组(DNA shuffling) 技术  37-38
    1.5.2 改组后突变体文库的筛选  38-39
  1.6 展望  39-41
  1.7 本文研究目的  41-42
第二章真菌免疫调节蛋白基因重组及其筛选  42-71
  2.1 材料与试剂  42-45
    2.1.1 材料  42-43
    2.1.2 常用的酶与试剂  43-44
    2.1.3 培养基  44-45
  2.2 实验方法  45-55
    2.2.1 真菌免疫调节蛋白基因重组  45-50
    2.2.2 构建表达载体  50-54
    2.2.3 菌落杂交法筛选真菌免疫调节蛋白基因重组文库  54-55
    2.2.4 真菌免疫调节蛋白重组基因检测分析  55
  2.3 结果分析  55-69
    2.3.1 真菌免疫调节蛋白基因重组  55-57
    2.3.2 构建表达载体  57-58
    2.3.3 菌落杂交法筛选真菌免疫调节蛋白基因重组文库  58-59
    2.3.4 重组真菌免疫调节蛋白基因检测分析  59-69
  2.4 讨论  69-71
第三章重组真菌免疫调节蛋白表达纯化及其功能检测  71-90
  3.1 材料与试剂  71-73
    3.1.1 材料  71
    3.1.2 其他试剂与酶  71-72
    3.1.3 培养基  72-73
  3.2 实验方法  73-80
    3.2.1 重组真菌免疫调节蛋白诱导表达  73-74
    3.2.2 表达产物的纯化  74-75
    3.2.3 重组真菌免疫调节蛋白浓度测定  75
    3.2.4 血细胞凝集实验  75-76
    3.2.5 真菌免疫调节蛋白诱导产生细胞因子  76-80
  3.3 结果分析  80-89
    3.3.1 重组蛋白相对表达产量的比较  80-82
    3.3.2 重组真菌免疫调节蛋白浓度测定  82-84
    3.3.3 血细胞凝集实验  84-86
    3.3.4 真菌免疫调节蛋白诱导产生细胞因子  86-89
  3.4 讨论  89-90
第四章总结与展望  90-94
  4.1 研究总结  90-91
    4.1.1 基因重组真菌免疫调节蛋白的筛选  90-91
    4.1.2 重组真菌免疫调节蛋白表达纯化及其功能检测  91
  4.2 创新点  91-92
  4.3 研究展望  92-94
    4.3.1 基因重组真菌免疫调节蛋白的筛选检测  92
    4.3.2 重组蛋白表达纯化及其功能检测  92-94
参考文献  94-104
致谢  104-106
攻读学位期间发表的学术论文及申请的专利目录  106-107

基因重组真菌免疫调节蛋白的筛选与功能检测

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