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不同产地的大戟科狼毒的质量分析和比较

作　者: 乞超
导　师: 陈振江
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 药物化学
关键词: 狼毒 DNA提取 ISSR技术 SDS-PAGE凝胶电泳技术高效液相色谱法气相色谱-质谱联用技术挥发油
分类号: R282.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

狼毒味苦；辛；性平，有大毒。主治包括水肿腹胀、痰食虫积、心腹疼痛以及结核等。《中药大辞典》药材来源为瑞香科植物瑞香狼毒或大戟科植物狼毒大戟、月腺大戟的根。本课题是以大戟科狼毒的干燥的根为研究对象，通过对六种不同产地的大戟科狼毒的根的DNA的提取，利用ISSR技术测量其基因组的差异和遗传距离的远近，可以观察到不同产地大戟科狼毒的种间变异。同时利用SDS-PAGE凝胶电泳法测量六种不同产地的大戟科狼毒的有效蛋白质分子量，观察比较其蛋白质分子量的不同加以区分。然后采取高效液相法对不同产地大戟科狼毒中的抗癌成分岩大戟内酯B和大黄素甲醚的含量进行测定及对湖北产大戟科狼毒做HPLC指纹图谱分析，通过以上几个部分的综合分析，判断总结对不同地域不同产地的大戟科狼毒的质量进行了比较区分，从而可以在以后的用药中进行有目的的挑选，达到进一步有效利用这一药用资源的目的。同时通过对本课题的研究可以清楚的了解到不同区域所产的大戟科狼毒的化学成分，某化学成分所占有的比例及含量以及不同区域不同产地所产的大戟科狼毒化学成分不同的原因等对该药物的使用产生影响的相关问题。本文包括了文献研究；利用ISSR技术有效检测六种不同产地的大戟科狼毒的基因组的差异；利用SDS-PAGE法测量六种不同产地的大戟科狼毒的蛋白质分子量；采用高效液相色谱法测量六种不同产地的大戟科狼毒中的岩大戟内酯B和大黄素甲醚的含量；采用高效液相色谱法对湖北产的大戟科狼毒做了指纹图谱研究；采用气相色谱-质谱联用技术分析六种不同产地的大戟科狼毒中挥发油成分等几部分内容。ISSR的实验结果表明了六种不同产地的大戟科狼毒的基因组DNA存在差异；而且通过凝胶电泳测量其蛋白质含量也发现了此六种不同产地的大戟科狼毒的蛋白质分子量存在着差异；通过高效液相色谱法测量六种不同产地的大戟科狼毒中的岩大戟内酯B和大黄素甲醚发现其两种对抑制肿瘤有明显效果的成分在不同产地的大戟科狼毒中含量各不相同，其中甘肃宁夏产的大戟科狼毒中岩大戟内酯B的含量最高为1.86mg/g,而湖北蕲春产的大戟科狼毒岩大戟内酯B的含量最低为0.49mg/g。而大黄素甲醚以湖北蕲春产的大戟科狼毒含量最高为1.46mg/g,而黑龙江哈尔滨产的大戟科狼毒中大黄素甲醚的含量最低为0.27mg/g.其指纹图谱研究发现，湖北产的大戟科狼毒的相似度超过了90%。通过使用气相色谱-质谱联用技术分析六种不同产地的大戟科狼毒中挥发油成分发现六种不同产地的大戟科狼毒挥发油成分基本相似，但是在含量和化合物种类上有细微的差别。本课题的研究为大戟科狼毒挥发油成分的定性分析提供了依据，并且大戟科狼毒药材的质量控制研究提供了依据，为不同区域不同产地的大戟科狼毒药材的临床合理用药提供了参考，为大戟科狼毒中的岩大戟内酯B对照品的制备提供了帮助,为大戟科狼毒的种质及遗传信息的研究提供了有效的依据。同时本课题也为高效液相色谱法测量岩大戟内酯B的含量提供了有效的条件参考。并且也为ISSR分子标记技术应用于大戟科植物基因组DNA的差异的研究提供了有效的反应条件的参考。

全文目录

目录  3-7
摘要  7-9
Abstract  9-14
前言  14-17
第一章利用高效液相法测定大戟科狼毒中的岩大戟内酯 B 和大黄素甲醚的含量  17-39
  1. 测定大戟科狼毒中的岩大戟内酯B的含量  17-20
    1.1 材料和仪器  17-18
    1.2 提取  18-19
    1.3 色谱柱条件  19
    1.4 对照品溶液制备  19
    1.5 稳定性试验  19
    1.6 线性考察  19-20
    1.7 精密度试验  20
    1.8 重复性试验  20
    1.9 加样回收试验  20
  2. 供试品含量分析  20-21
  3. 讨论  21-22
  4. 不同产地的大戟科狼毒岩大戟内酯 B 高效液相色谱图  22-29
  5. 测定大戟科狼毒中的大黄素甲醚的含量  29-31
    5.1 材料和仪器  29-30
    5.2 提取方法  30
    5.3 色谱柱条件  30
    5.4 稳定性试验  30
    5.5 线性考察  30-31
    5.6 精密度试验  31
    5.7 重复性试验  31
    5.8 加样回收试验  31
    5.9 供试品含量分析  31
  6. 讨论  31-32
  7. 不同产地的大戟科狼毒中大黄素甲醚的高效液相色谱图  32-39
第二章湖北产大戟科狼毒 HPLC 指纹图谱分析  39-47
  1. 材料与仪器  39
    1.1 材料  39
    1.2 仪器  39
  2. 供试品溶液的制备  39-40
    2.1 药典法  39-40
    2.2 加热回流法  40
  3. 对照品溶液的制备  40
  4. 色谱柱条件  40
  5. 方法学考察  40-41
    5.1 精密度试验  40
    5.2 重复性试验  40-41
    5.3 稳定性试验  41
  6. 结果与分析  41-45
  7. 讨论  45-47
    7.1 提取方法的考察  45
    7.2 流动相的选择  45-46
    7.3 检测波长的选择  46
    7.4 内参照物的选择  46
    7.5 相似度结果分析  46-47
第三章利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定不同产地大戟科狼毒的蛋白质分子量  47-56
  1. 仪器与试剂  47-48
  2. 实验方法  48-51
    2.1 样品制备称  48-49
    2.2 试剂的配制  49-50
    2.3 标准蛋白质样品处理  50
    2.4 电泳操作  50-51
    2.5 染色与脱色  51
  3. 结果与分析  51-54
    3.1 图谱分析  51-52
    3.2 计算四种样品蛋白质成分的分子量  52-54
    3.3 实验的重现性  54
    3.4 实验结果  54
  4. 讨论  54-55
  5. 总结  55-56
第四章利用ISSR分子标记技术鉴别不同产地大戟科狼毒的DNA的差别  56-76
  1. 所用试剂与仪器  56-58
    1.1 试剂  56-57
    1.2 仪器  57-58
    1.3 实验材料  58
  2. 实验方法  58-62
    2.1 不同产地大戟科狼毒的DNA的提取  58-59
    2.2 DNA的纯化  59
    2.3 ISSR引物的选择  59-60
    2.4 ISSR-PCR扩增  60-62
      2.4.1 ISSR反应条件的优化和反应体系的建立  60-61
      2.4.2 ISSR-PCR反应体系  61
      2.4.3 PCR扩增程序及参数  61-62
      2.4.4 ISSR扩增产物检测  62
      2.4.5 结果统计和分析  62
  3. ISSR-PCR扩增产物电泳结果  62-66
  4. 数据分析  66-70
    4.1 不同产地的的大戟科狼毒大戟遗传相似性分析  67-69
      4.1.1 引物UBC891扩增后经统计软件得到的遗传相似性结果和聚类树状图  67-68
      4.1.2 引物UBC818扩增后经统计软件得到的遗传相似性结果和聚类树状图  68-69
    4.2 引物UBC818和UBC891扩增统计结果分析  69-70
  5. 环境因素对不同产地的大戟科狼毒的遗传多样性的影响  70-73
  6. 讨论  73-74
    6.1 正交法运用于PCR反应条件的优化  73
    6.2 退火温度的影响  73-74
    6.3 实验的稳定性讨论  74
  7. 结论  74-76
第五章不同产地大戟科狼毒挥发油成分的分析与比较  76-90
  1. 仪器与材料  76
    1.1 仪器  76
    1.2 材料与试剂  76
  2. 挥发油样品的制备  76-77
  3. GC-MS的条件  77
  4. 数据分析与质谱峰检查结果  77-78
  5. 气质联用结果分析  78-79
  6. 讨论  79-80
  7. 不同产地大戟科狼毒挥发油气质联用检测相关图表  80-90
第六章讨论  90-92
第七章结语  92-94
参考文献  94-98
文献综述  98-112
  文献综述参考文献  108-112
致谢  112-113

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