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食源性沙门氏菌的PCR快速检测技术研究

作　者: 周晓清
导　师: 赵改名
学　校: 河南农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 沙门氏菌荧光定量PCR 热处理 DNA降解逆转录荧光定量PCR
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

沙门氏菌是一种广泛分布于自然界的危害极大的肠道致病菌，人们会因为直接接触或食用被污染的食物而感染，并导致腹泻或系统性疾病，在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首。目前，检测方法在控制食物污染和传播方面仍占有重要地位，然而现有的检测方法耗时较长或者检测灵敏度较低等不能满足及时准确评价食品中微生物安全性的需求，因此，有必要建立快速灵敏的检测方法为保障食品安全提供有效的检测工具。本研究通过优化建立了以DNA为基础的荧光定量PCR检测方法，并进行特异性、灵敏度、重复性等检测以及食品添加实验分析方法的适用性和可靠性。同时，研究了不同热处理对沙门氏菌DNA降解的影响，以及死亡菌体对荧光定量PCR检测结果的影响。最后优化建立了基于区分死活菌体的逆转录荧光定量PCR检测条件，并验证死亡菌体对检测结果的影响。研究结果表明：(1)优化后的荧光定量PCR检测条件为：95°C/30s；然后95°C/5s，64°C/34s，此步骤为40个循环；最后添加融解曲线分析。反应体系总量为20μl，其中上下游引物(1μM)的添加量为2μl。建立的荧光定量PCR方法特异性强，重复性良好，灵敏度高而且不需要前增菌大大缩短了检测时间，整个实验操作过程可在4h内完成。将此方法应用于人工污染食品中沙门氏菌的检测，结果表明生鲜猪肉、调理鸡肉和鲜牛奶样品中沙门氏菌的检测灵敏度分别为1.9×10~2cfu/g、4.5×10~2cfu/g和1.5×10~2cfu/ml。通过与微生物传统计数方法的检测结果进行比较，结果显示不论在定性还是定量方面与传统方法的符合率为100%，可用于食品中沙门氏菌的定量检测。(2)食品加工和消费中常见的热处理65°C/20min、85°C/30min、沸水浴/3min和121°C/15min能完全杀死菌液中沙门氏菌；加热温度越高对基因组DNA的破坏性越大，但是加热并不能使细菌DNA完全降解消亡，经不同温度和时间加热处理后，目的基因片段仍不同程度地残存在死亡的细胞当中，并且消亡速度非常缓慢。(3)热致死沙门氏菌中残存的基因组DNA或DNA片段对荧光定量PCR检测结果影响较大，对人体健康没有威胁的死亡菌体样品经检测结果为阳性，表明以DNA为基础的荧光定量PCR不能有效地区别死活菌，此方法并不适用于含有热致死菌体的样品例如加工肉制品、即食食品中沙门氏菌的检测，而较适用于生鲜食品的检测。(4)优化后的逆转录荧光定量PCR反应条件为：42°C/5min，95°C/5s；然后95°C/5s，67°C/34s，此步骤为40个循环；最后添加融解曲线分析。反应体系总量为25μl，其中上下游引物(1μM)添加量分别为4μl。建立的逆转录荧光定量PCR不需前增菌处理，整个检测过程在4h内即可完成，明显地缩短了检测时间。另外，生鲜猪肉、调理鸡肉和鲜牛奶样品中沙门氏菌的灵敏度分别为1.9×10~2cfu/g、4.5×10~3cfu/g和1.5×10~3cfu/ml比荧光定量PCR的灵敏度低。比较该方法与荧光定量PCR的定量结果发现，定量检测不如荧光定量PCR，但是它的最大优点是可以区分死活菌弥补了荧光定量PCR的不足，因此更适用于样品中沙门氏菌的定性检测。

全文目录

致谢  4-5
英文缩写符号及中英文对照表  5-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-19
  1.1 沙门氏菌的介绍  9-10
    1.1.1 沙门氏菌的生物学特性  9
    1.1.2 沙门氏菌的致病性  9-10
  1.2 沙门氏菌的快速检测技术研究现状  10-13
    1.2.1 以免疫学为基础的检测方法  10-12
    1.2.2 以核酸为基础的检测方法  12-13
  1.3 PCR 技术在沙门氏菌检测中的应用  13-19
    1.3.1 实时荧光定量 PCR  13-18
    1.3.2 逆转录荧光定量 PCR  18-19
2 引言  19-20
3 材料与方法  20-28
  3.1 实验材料、试剂和仪器设备  20-22
    3.1.1 实验材料  20
    3.1.2 实验菌株  20
    3.1.3 实验试剂  20-21
    3.1.4 主要仪器、设备和耗材  21-22
  3.2 试验方法  22-28
    3.2.1 菌株培养  22
    3.2.2 DNA 的提取和纯化  22-23
    3.2.3 RNA 的提取和纯化  23-24
    3.2.4 DNA 和 RNA 的琼脂糖凝胶电泳分析  24
    3.2.5 引物的设计与合成  24
    3.2.6 实时荧光定量 PCR 的优化和检测  24-26
    3.2.7 逆转录实时荧光定量 PCR 的优化和检测  26-27
    3.2.8 沙门氏菌的食品添加实验  27-28
    3.2.9 热处理实验  28
4 结果与分析  28-52
  4.1 荧光定量 PCR 检测食源性沙门氏菌方法的研究  28-36
    4.1.1 检测条件的优化结果  28-30
    4.1.2 特异性  30-31
    4.1.3 灵敏度  31-32
    4.1.4 重复性  32-33
    4.1.5 食品中沙门氏菌的检测分析  33-36
  4.2 不同热处理对沙门氏菌 DNA 降解的影响  36-41
    4.2.1 不同加热处理对沙门氏菌存活状况的影响  36
    4.2.2 不同热处理对死亡菌体 DNA 降解速度的影响  36-39
    4.2.3 死亡菌体 DNA 对荧光定量 PCR 检测的影响  39-41
  4.3 逆转录荧光定量 PCR 检测食源性沙门氏菌方法的研究  41-50
    4.3.1 检测条件的优化结果  41-44
    4.3.2 灵敏度  44-45
    4.3.3 重复性  45-46
    4.3.4 食品中沙门氏菌的检测分析  46-49
    4.3.5 不同热处理对检测结果的影响  49-50
  4.4 荧光定量 PCR 与逆转录荧光定量 PCR 检测沙门氏菌结果的比较  50-52
    4.4.1 检测灵敏度对比  50-51
    4.4.2 定量检测结果对比  51-52
    4.4.3 死亡菌体的检测结果对比  52
5 讨论和结论  52-55
  5.1 讨论  52-54
    5.1.1 荧光定量 PCR 检测方法的建立和初步应用  52-53
    5.1.2 热处理对沙门氏菌 DNA 降解的影响  53
    5.1.3 逆转录荧光定量 PCR 检测方法的建立和初步应用  53-54
  5.2 结论  54-55
参考文献  55-61
本研究创新点  61-62
ABSTRACT  62-63

食源性沙门氏菌的PCR快速检测技术研究

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