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壳聚糖提高香鱼免疫力的生理生化及分子机理研究

作　者: 金思
导　师: 龚一富
学　校: 宁波大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 香鱼壳聚糖非特异性免疫溶菌酶过氧化物酶酸性磷酸酶 hsp70 nkef lect2 荧光定量PCR cDNA末端快速扩增生物信息学
分类号: S963
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

香鱼（Plecoglossus altivelis）是一年生小型珍稀名贵洄游性经济鱼类，随着养殖技术和病害防治技术的完善，已经作为新的养殖品种在许多地区广泛养殖。但香鱼的生长很大程度上受到水温、光照等生长环境因素的制约。同时随着养殖业规模不断扩大，集约化和工厂化程度越来越高，养殖水域污染日益严重，导致病害的频繁发生，严重困扰着香鱼等水产养殖业的健康发展。因此研究香鱼的抗逆性基因和免疫增强剂对香鱼健康养殖具有重要的科学意义和理论。“分子伴侣”——热休克蛋白(hsp70)属于热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员，各种环境、生理及病理的应激能够引起热休克蛋白，尤其是hsp70基因的高表达。Hsp70参与蛋白的正确折叠、定位，对细胞的生长、分化、凋亡和各种环境适应起着重要作用。同时Hsp70蛋白还可调节细胞和机体的免疫，保护细胞、组织及动物体经受可能致死的热伤害以及其他有害刺激如缺氧、细菌感染等。本论文研究了免疫增强剂壳聚糖对香鱼免疫器官免疫功能的影响，采用RACE技术从香鱼克隆了hsp70基因全长cDNA序列，并进行了生物信息学分析，采用荧光定量PCR技术研究了壳聚糖刺激下对免疫相关基因表达的影响，初步探讨了壳聚糖促进香鱼免疫力的生理生化和分子机理。为研究免疫增强剂对香鱼生长及非特异性免疫功能影响，本文通过较长时间免疫增强剂壳聚糖混饲投喂的方法，综合研究免疫增强剂壳聚糖对香鱼血液中红细胞、白细胞数量，血清、肝脏、肾脏、脾、肌肉、鳃的过氧化物酶（POD）、溶菌酶（LSZ）、酸性磷酸酶（ACP）活性等非特异性指标的影响。结果表明，随着壳聚糖浓度的增加，香鱼血液红细胞和白细胞数量呈先上升后下降的趋势，当壳聚糖浓度为0.5%时，香鱼血液中红细胞和白细胞总数达最大值。经1%，2%和4%壳聚糖处理的香鱼红细胞数较对照均有所下降。壳聚糖对香鱼溶菌酶活性的影响结果表明，壳聚糖对香鱼肌肉组织溶菌酶活性的影响差异不显著，但壳聚糖能显著提高香鱼血清、脾脏、肝脏、肾脏和鳃丝溶菌酶活性，当饲料中添加1%浓度壳聚糖时，各组织中溶菌酶活性均达到最大值。研究不同浓度壳聚糖对香鱼过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶（ACP）活性的影响，结果表明，在不同浓度壳聚糖处理下，香鱼的血清、脾脏、肝脏、肾脏、鳃丝和肌肉组织中POD活性和ACP活性均呈先增加后下降的趋势，当壳聚糖浓度为1%时，POD活性和ACP活性均达到最大值。说明1%壳聚糖能显著提高香鱼的免疫活性，是香鱼免疫提高的最佳壳聚糖浓度。本研究采用RACE技术克隆了香鱼的hsp70基因cDNA全长序列（命名为Pahsp70），该序列全长2361bp，开放阅读框长1956bp。经生物信息学预测，该基因能编码一个由651个氨基酸组成、分子量为71.22kDa、等电点(PI)为5.16的蛋白质。推导的氨基酸序列经多重序列比对分析表明，香鱼HSP70蛋白与大西洋鲑、红笛鲷、牙鲆、团头鲂、鲢、草鱼和斑马鱼的HSP70同源性达到了94%。香鱼HSP70蛋白编码的氨基酸具有5个功能结构域，分别是GGMP序列、HSP70签名基序、ATP酶结合位点、Ca+2结合区域和C-末端细胞质定位特征序列“EEVD”。PaHSP70蛋白质二级结构预测结果表明，HSP70蛋白中有41.63%氨基酸参与形成α-螺旋(alpha helix)，27.65%参与形成伸展链(extended strand)，13.67%氨基酸参与形成β转角(beta turn)，另有33.03%氨基酸参与形成无规卷曲(random coil)。使用SWISS-MODEL同源建模方法对PaHSP70蛋白三维空间结构进行预测，结果表明，HSP70蛋白的三维模型为EF型，与酶的典型三级结构特征相似，即2片叶状结构的是中间一裂沟。系统进化树分析结果表明，鱼类HSP70蛋白与其他动物分别成簇，香鱼HSP70蛋白与虹鳟HSP70蛋白进化相关性最高，各物种HSP70蛋白的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致，揭示了HSP70蛋白在动物进化过程中的保守性。香鱼hsp70基因在不同组织中表达结果表明，香鱼hsp70基因在香鱼肝脏、肾脏、脾脏、腮丝、肠和肌肉中均有表达，在肝、肾和脾等免疫组织中表达最高，表明该基因可能与香鱼的免疫功能相关。利用荧光定量PCR技术研究不同浓度壳聚糖对香鱼免疫相关基因（hsp70, lect2,nkef）mRNA的表达水平的影响，结果表明，香鱼肝脏中hsp70在低浓度壳聚糖刺激下表达有所增加，在1%浓度壳聚糖处理下基因表达达到最高(P<0.01)，随着浓度的进一步增大，表达逐渐下降。Lect2基因在肝脏、肾脏和脾脏等免疫器官中的基因表达趋势一致，均随着壳聚糖浓度的增减呈先上升后下降的趋势，当壳聚糖浓度达1%时，Lect2基因表达量达到最大值(P<0.01)。Nkef基因在肝脏中的表达最明显，在1%的浓度组表达最高（P<0.01），但是在脾脏中，壳聚糖对该基因的影响不显著。在1%壳聚糖处理下香鱼免疫相关基因（hsp70, lect2, nkef）表达量达最大值，与1%壳聚糖处理下香鱼免疫指标溶菌酶活性、POD和ACP活性、最大值的结果相一致，基因表达表达与免疫指标之间存在一定的相关性，说明壳聚糖可能通过调节免疫相关基因的表达，从而提高香鱼免疫活性，最终提高香鱼的免疫力。

全文目录

论文摘要  4-7
Abstract  7-12
引言  12-13
第一章文献综述  13-20
  1.1 香鱼养殖状况  13-14
    1.1.1 香鱼的生物学特性  13
    1.1.2 香鱼养殖现状及问题  13-14
  1.2 壳聚糖一种新型免疫增强剂  14-17
    1.2.1 免疫增强剂简介  14
    1.2.2 壳聚糖的免疫增强机理  14-15
    1.2.3 壳聚糖对鱼类非特异性免疫机能影响的研究  15-16
    1.2.4 影响壳聚糖作用效果的因素  16-17
    1.2.5 壳聚糖在水产养殖中应用前景  17
  1.3 与鱼类免疫功能相关基因的研究进展  17-20
第二章投喂壳聚糖对香鱼非特异性免疫指标的影响  20-29
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 实验动物  20
    2.1.3 主要仪器设备  20
    2.1.4 主要试剂  20
    2.1.5 饲养配制  20-21
  2.2 实验方法  21-23
    2.2.1 饲养管理  21-22
    2.2.2 样品采集  22
    2.2.3 样品处理  22
    2.2.4 指标测定方法  22-23
    2.2.5 实验数据处理  23
  2.3 结果与分析  23-26
    2.3.1 壳聚糖对香鱼血液生理特性的影响  23-24
    2.3.2 壳聚糖对香鱼溶菌酶(LSZ)活性的影响  24-25
    2.3.3 壳聚糖对香鱼过氧化物酶(POD)活性的影响  25
    2.3.4 壳聚糖对香鱼酸性磷酸酶(ACP)活性的影响  25-26
  2.4 讨论  26-29
第三章香鱼热休克蛋白（hsp70）基因cDNA 序列的克隆和分析  29-45
  3.1 材料  29-30
    3.1.1 实验动物  29
    3.1.2 主要仪器设备  29
    3.1.3 主要试剂  29-30
  3.2 实验方法  30-35
    3.2.1 RNA 提取  30
    3.2.2 逆转录合成 cDNA 第一链  30-31
    3.2.3 hsp70 基因核心序列扩增  31
    3.2.4 目的片段的回收、连接、克隆和测序  31-32
    3.2.5 hsp70 基因 3’RACE 和 5’RACE 的克隆方法  32-33
    3.2.6 hsp70 基因全长 cDNA 的获得  33-34
    3.2.7 hsp70 基因的生物信息学分析  34-35
  3.3 结果与分析  35-43
    3.3.1 hsp70 基因的克隆及生物信息学分析  35-42
    3.3.2 香鱼 hsp70 基因的组成型表达  42-43
  3.4 讨论  43-45
第四章壳聚糖对香鱼免疫相关基因表达的影响  45-54
  4.1 材料  45-46
    4.1.1 实验材料  45
    4.1.2 实验材料  45
    4.1.3 主要仪器设备  45
    4.1.4 主要试剂  45
    4.1.5 饲养配制  45-46
  4.2 实验方法  46-47
    4.2.1 引物设计及合成  46
    4.2.2 总 RNA 提取和反转录  46
    4.2.3 标准曲线的制作  46
    4.2.4 实时荧光定量 PCR 检测样品中目标基因和β-actin 含量  46-47
    4.2.5 实验数据处理  47
  4.3 结果与分析  47-51
    4.3.1 荧光定量 PCR 工作曲线  47-49
    4.3.2 壳聚糖对香鱼免疫相关基因的影响  49-51
  4.4 讨论  51-54
第五章结论  54-55
参考文献  55-60
在学研究成果  60-61
致谢  61

壳聚糖提高香鱼免疫力的生理生化及分子机理研究

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