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迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗的研制和免疫效果

作　者: 李杰
导　师: 莫照兰
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 水产养殖
关键词: 迟缓爱德华氏菌LSE40 基因缺失 弱毒株 弱毒疫苗 免疫效果 EseG 分泌信号肽
分类号: S948
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)可引起鱼类的爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，导致出血性败血症。疫苗免疫是预防鱼类病害的重要手段。弱毒疫苗可有效刺激机体系统免疫应答，通过浸泡、口服途径提供有效的免疫保护，实用而高效。以弱毒疫苗为载体可研制鱼类多价疫苗。本研究构建了迟缓爱德华氏菌LSE40的多株基因缺失株，筛选了11株弱毒株并检测它们对鱼的免疫保护效果。初步鉴定了LSE40III型分泌系统(T3SS)效应蛋白EseG的分泌信号肽，为进一步以迟缓爱德华氏菌T3SS为异源抗原呈递途径构建弱毒迟缓爱德华氏菌疫苗载体，进而研制鱼类多价疫苗奠定基础。一、迟缓爱德华氏菌LSE40ΔaroA突变株的特征及免疫效果LSE40ΔaroA突变株缺失了编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA。该突变株的细菌形态变长、分裂延迟，在TSB培养基的生长变慢、运动力和菌膜形成能力减弱，在DMEM培养基中不能自凝、3个T3SS输送器蛋白(EseB，EseC， EseD)的表达和分泌减弱，在鱼体内的存活能力下降，对鱼的毒力减弱。将LSE40ΔaroA以注射和浸泡途径免疫大菱鲆，可检测到免疫鱼的血清产生特异抗体，但免疫鱼不能抵抗致病性迟缓爱德华氏菌的感染。二、迟缓爱德华氏菌LSE40基因缺失株的构建及其毒力检测以迟缓爱德华氏菌LSE40的7个与毒力或营养相关基因(腺苷酸基琥珀酸合成酶编码基因purA，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶编码基因asd，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶aroA，T3SS调节蛋白编码基因esrB和装置蛋白编码基因esaC，T6SS装置蛋白编码基因evpH，RNA聚合酶sigma S调节蛋白编码基因rpoS)为靶基因，构建了2株单基因缺失株： LSE40ΔpurA，LSE40Δasd；7株双基因缺失株：LSE40ΔaroAΔesrB、LSE40ΔpurAΔesrB、LSE40ΔpurAΔaroA、LSE40ΔaroAΔesaC、LSE40ΔaroAΔrpoS、LSE40ΔaroAΔevpH、LSE40ΔesrBΔevpH；2株三基因缺失株： LSE40ΔaroAΔesrBΔevpH和LSE40ΔaroAΔesaCΔevpH。以蓝蔓龙检测LSE40ΔaroA和11株突变株的LD50，结果显示毒力下降了130-1000倍以上。三、迟缓爱德华氏菌弱毒株的免疫保护效果首先，以LSE40ΔaroA和11株弱毒株注射免疫蓝蔓龙鱼，发现LSE40ΔaroA、LSE40ΔaroAΔesaCΔevpH和LSE40ΔaroAΔesrBΔevpH三株弱毒株没有提供免疫保护；其他9株弱毒株提供21.7%-82.6%免疫保护率(RPS)。然后，取LSE40ΔaroA和有较高RPS的3株弱毒株LSE40ΔaroAΔesrB、 LSE40ΔaroAΔesaC和LSE40ΔaroAΔevpH浸泡免疫牙鲆，在免疫牙鲆的血清检测到特异性抗体效价，注射攻毒的RPS分别为0、45%、25%和20%，浸泡攻毒的RPS为0、100%、66.7%和66.7%。结果显示，LSE40ΔaroAΔesrB、LSE40ΔaroAΔesaC、LSE40ΔaroAΔevpH对牙鲆提供较好的免疫保护。最后，用LSE40ΔaroAΔesrB注射免疫大菱鲆，108和107cfu/ml免疫组的注射攻毒时免疫保护率分别为20%和10%，106cfu/ml免疫组不能提供免疫保护效果；以浸泡和口服途径免疫大菱鲆，均未能提供免疫保护。综合上述结果，弱毒疫苗对蓝蔓龙和牙鲆提供良好的免疫保护，对大菱鲆未提供免疫保护。四、迟缓爱德华氏菌T3SS效应蛋白分泌性信号肽的鉴定利用细菌的T3SS呈递异源抗原，可构建多价疫苗载体。本实验利用生物信息学方法预测分析LSE40T3SS效应蛋白EseG和输送器蛋白EseC的分泌性信号肽区域，构建待定分泌信号肽与内酰胺酶β-lactamase的融合表达载体，在迟缓爱德华氏菌表达，以westernblot检测融合蛋白的表达和分泌情况。结果显示，EseG的1-88aa具有分泌型信号肽的功能，为进一步研究以迟缓爱德华氏菌T3SS为异源抗原呈递途径打下基础。

全文目录


致谢  4-7
摘要  7-9
Abstract  9-12
目录  12-15
引言  15-16
第一章 文献综述  16-33
  第一节 迟缓爱德华氏菌的研究进展  16-28
    1.1.1 迟缓爱德华氏菌分类地位、分布特征和感染途径  16-18
    1.1.2 迟缓爱德华氏菌的致病机制  18-28
      1.1.2.1 黏附和入侵  18-20
      1.1.2.2 细胞毒素和胞外酶  20
      1.1.2.3 抗免疫杀伤机制  20-21
      1.1.2.4 细菌分泌系统  21-26
      1.1.2.5 密度感应系统  26-27
      1.1.2.6 铁摄取  27
      1.1.2.7 寡肽透过酶  27-28
  第二节 迟缓爱德华氏菌的防治  28-33
    1.2.1 化学治疗法  28
    1.2.2 免疫治疗防治法  28-33
      1.2.2.1 灭活疫苗  29-30
      1.2.2.2 空壳疫苗  30
      1.2.2.3 蛋白疫苗  30-31
      1.2.2.4 DNA疫苗  31
      1.2.2.5 弱毒疫苗  31-32
      1.2.2.6 外膜小泡疫苗  32-33
第二章 迟缓爱德华氏菌LSE40ΔaroA基因缺失株的特征及免疫效果  33-47
  2.1 材料与方法  33-37
    2.1.1 菌株和培养基  33-34
    2.1.2 实验鱼  34
    2.1.3 LSE40ΔaroA突变株表型的分析  34-35
      2.1.3.1 扫描电镜观察细菌形态  34
      2.1.3.2 培养基检测细菌的生长  34
      2.1.3.3 泳动实验  34-35
      2.1.3.4 菌膜形成  35
      2.1.3.5 细菌自凝  35
      2.1.3.6 迟缓爱德华氏菌输送器蛋白的检测  35
    2.1.4 LSE40ΔaroA突变株对大菱鲆的半数致死量  35
    2.1.5 LSE40ΔaroA在大菱鲆体内存活情况  35
    2.1.6 LSE40ΔaroA突变株对大菱鲆的免疫  35-36
      2.1.6.1 注射免疫  36
      2.1.6.2 浸泡免疫  36
    2.1.7 免疫相关基因的表达  36-37
      2.1.7.1 RNA提取、DNA消化和反转录  36-37
      2.1.7.2 实时定量PCR  37
  2.2 结果  37-44
    2.2.1 野生型LSE40 和突变株LSE40ΔaroA的表型特征比较  37-39
    2.2.2 T3SS输送器蛋白的分泌  39
    2.2.3 毒力检测  39-40
    2.2.4 细菌在鱼体内的存活时间  40-41
    2.2.5 突变株LSE40ΔaroA对大菱鲆的免疫效果  41-43
      2.2.5.1 注射免疫效果  41-42
      2.2.5.2 浸泡免疫  42-43
    2.2.6 免疫相关基因的表达  43-44
  2.3 讨论  44-47
第三章 迟缓爱德华氏菌基因缺失突变株的构建、毒力检测及其免疫保护效果  47-73
  3.1 材料和方法  48-57
    3.1.1 菌株、质粒、细菌培养、实验鱼和引物  48
    3.1.2 基因缺失突变株的构建  48-54
      3.1.2.1 purA基因缺失片段的构建  50-52
      3.1.2.2 含有purA基因缺失片段的pRE112 质粒构建  52-53
      3.1.2.3 两次同源重组构建LSE40ΔpurA基因缺失株  53-54
      3.1.2.4 其它突变株的构建  54
    3.1.3 突变株对蓝蔓龙的半数致死量  54-55
    3.1.4 注射免疫蓝蔓龙  55
    3.1.5 浸泡免疫牙鲆  55-56
    3.1.6 LSE40ΔaroAΔesrB免疫大菱鲆  56-57
      3.1.6.1 注射免疫  56
      3.1.6.2 浸泡免疫  56-57
      3.1.6.3 灌喂免疫  57
  3.2 结果  57-69
    3.2.1 突变株的鉴定及表型特征  57-60
      3.2.1.1 LSE40ΔpurA  57-58
      3.2.1.2 LSE40Δasd  58-59
      3.2.1.3 LSE40ΔaroAΔevpH和LSE40ΔpurAΔaroA  59-60
      3.2.1.4 LSE40ΔpurAΔesrB 、 LSE40ΔaroAΔesrB 、 LSE40ΔevpHΔesrB 和LSE40ΔaroAΔevpHΔesrB  60
    3.2.1.5 LSE40ΔaroAΔesaC和LSE40ΔaroAΔesaCΔevpH  60-62
      3.2.1.6 LSE40ΔaroAΔrpoS  61-62
    3.2.2 突变株对蓝蔓龙的半数致死量  62-63
    3.2.3 弱毒株对蓝蔓龙的免疫保护  63-64
    3.2.4 4 株弱毒株浸泡免疫牙鲆的保护  64-66
      3.2.4.1 弱毒株在鱼体内的存活时间  64-65
      3.2.4.2 血清抗体检测  65
      3.2.4.3 免疫保护  65-66
    3.2.5 LSE40ΔaroAΔesrB对大菱鲆的免疫保护  66-69
      3.2.5.1 注射免疫  66-68
      3.2.5.2 浸泡免疫  68
      3.2.5.3 灌喂免疫  68-69
  3.3 讨论  69-73
第四章 减毒迟缓爱德华氏菌载体疫苗的构建：T3SS效应蛋白分泌性信号肽的鉴定  73-81
  4.1 材料与方法  74-76
    4.1.1 菌株、培养基、抗体和质粒  74-75
    4.1.2 信号肽序列分析  75
    4.1.3 预测信号肽重组表达质粒的构建  75
    4.1.4 迟缓爱德华氏菌T3SS的诱导表达、蛋白提取和检测  75-76
  4.2 结果  76-79
    4.2.1 分子生物学分析结果  76
    4.2.2 预测信号肽重组表达质粒的构建  76-77
    4.2.3 融合蛋白的检测  77-79
  4.3 讨论  79-81
结论  81-82
参考文献  82-94
简历  94-95
发表文章和申请专利  95

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 水产药物学、药理学
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