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猪链球菌2型Ⅲ型限制与修饰系统mod基因缺失株的构建及其生物学特性研究

作　者: 刘朋
导　师: 金梅林
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌 Ⅲ型限制与修饰系统 mod基因基因缺失基因芯片
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪链球菌2型(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患传染病原体,可以引起猪脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎、急性死亡等,给养猪业带来严重的经济损失。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)成分的不同可将猪链球菌分为33个血清型(1-31型,33型和1／2型)。它可以通过伤口和呼吸道感染,导致的人的发病和死亡。此病呈全球性分布,不仅给全世界养猪业造成巨大的经济损失,而且对相关从业人员的健康亦构成严重威胁。猪链球菌2型Ⅲ型限制与修饰系统(R-M)的mod基因是一种调节基因,能够调节多种蛋白的表达。它是经过体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选得到,在细菌感染致病的过程中有重要的作用。本研究构建了猪链球菌2型mod基因的缺失突变株和质粒介导的互补菌株,并对缺失菌株和互补菌株生物学特性进行了研究,并通过基因芯片技术在转录水平研究其影响表达的基因,为进一步研究猪链球菌2型的致病机制进行了初步的探索。本研究主要从一下几个方面展开：1.猪链球菌2型mod基因缺失突变株和互补菌株的构建与鉴定以SS2野生株SC-19的基因组为模板,通过PCR扩增mod基因上下游臂以及全长序列；以质粒pghost9为模板,扩增ermb红霉素抗性基因；利用温敏型“自杀性”质粒pSET4s构建质粒pSET4s-modU-ermb-modD,将重组通过电穿孔技术质粒导入野生菌SC-19中,通过抗生素及温度双标记筛选得到缺失菌株△mod。另一方面,将mod基因的全长序列插入pSET2s中构建互补质粒pSET2s-mod,并电转入mod基因缺失株△mod中,通过抗性筛选得到质粒介导的互补菌株cmod。采用组合PCR验证和Southern blot杂交的方法证实mod基因的缺失突变株构建成功。2.Mod基因缺失对细菌基本生物学性状的影响在相同的条件下,观察SS2野生株SC-19与突变株△mod的基本生物学性状有无明显差异。结果发现,mod基因的缺失没有明显影响细菌的生长曲线及革兰氏染色情况,但通过扫描电镜和透射电镜的观察发现突变株的外表面的物质增多、增厚,互补菌株与野生菌株相比表面没有明显差异。3.Mod基因缺失对细菌毒力的影响①相同剂量(2×106)的野生株SC-19和突变株△mod通过滴鼻感染仔猪。结果发现,野生株SC-19对动物有致死性,而mod基因缺失的突变株则丧失了对宿主动物的致病性。②用等比例的野生株／突变株混合菌感染仔猪,对易感组织中的细菌进行平皿计数培养,结果发现mod基因缺失突变株在各组织中的定植能力严重下降。在野生株／突变株混合感染动物组中发现,各组织脏器中除了能检测到野生株细菌外,还在扁桃体和血中发现有极少量的突变株细菌的存在。4.Mod基因调控猪链球菌2型SC-19基因表达分析利用基因芯片技术,我们在转录水平上对野生株SC-19和突变株△mod的表达谱进行了比较,结果发现,在突变株△mod中有83个基因的转录水平较野生株SC-19有显著的上调,其中有20个假设蛋白,主要包括糖酵解、ATP结合、铁离子结合、氧化磷酸化、柠檬酸循环、脂肪酸生物合成以及嘌呤代谢等；有108个基因下调,其中有28个假设蛋白,主要涉及过程包括嘧啶代谢、ABC转运系统、磷酸转移酶系统等。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表(Abbreviation)  11-12
1 文献综述  12-28
  1.1 猪链球菌2型研究进展  12-19
    1.1.1 前言  12
    1.1.2 生物学特性  12-13
    1.1.3 毒力因子及发病机理  13-16
    1.1.4 人类感染猪链球菌的临床及流行病学特征  16-19
  1.2 Ⅲ型限制与修饰系统(R-M)研究进展  19-28
    1.2.1 Ⅲ型限制与修饰系统简介  19-22
    1.2.2 限制与修饰系统相变的发生  22-24
    1.2.3 Ⅲ型限制与修饰系统发生相变的作用  24-26
      1.2.3.1 噬菌体感染的屏障或者自然转化下的遗传变异  24-25
      1.2.3.2 通过自身DNA的降解并被相邻细胞吸收  25
      1.2.3.3 基因调控  25-26
    1.2.4 Ⅲ型限制与修饰系统相变调控作用的进一步发现  26-27
    1.2.5 展望  27-28
2 猪链球菌2型mod基因缺失株的构建及生物学特性研究  28-51
  2.1 研究目的与意义  28-29
  2.2 材料  29-32
    2.2.1 菌种和质粒  29
    2.2.2 主要药品及试剂  29-30
    2.2.3 主要培养基及抗生素的配制  30
    2.2.4 主要缓冲液的配制  30-31
    2.2.5 试验动物  31
    2.2.6 本研究中使用的引物  31-32
  2.3 方法  32-51
    2.3.1 猪链球菌2型基因组DNA的制备  32
    2.3.2 猪链球菌2型mod基因上下游同源臂及全长序列的克隆  32-33
    2.3.3 PCR或酶切产物的回收与纯化  33
    2.3.4 目的片段与载体的连接  33-34
    2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  34
    2.3.6 载体的去磷酸化  34
    2.3.7 连接产物的转化  34-35
    2.3.8 质粒小量提取  35
    2.3.9 重组载体的鉴定  35
    2.3.10 抗性筛选基因—红霉素抗性基因的扩增  35
    2.3.11 自杀性重组质粒的构建  35-36
    2.3.12 自杀性重组质粒的快速PCR鉴定  36
    2.3.13 自杀性重组质粒的酶切鉴定  36
    2.3.14 互补质粒的构建  36
    2.3.15 互补质粒的快速PCR鉴定  36
    2.3.16 互补质粒的酶切鉴定  36
    2.3.17 自杀性重组质粒和互补质粒的大量提取  36-37
    2.3.18 猪链球菌2型RNA的提取  37-38
    2.3.19 猪链球菌2型mod基因缺失突变株和互补菌株的构建及鉴定  38-41
    2.3.20 猪链球菌2型mod基因缺失株的Southern杂交鉴定  41-44
    2.3.21 mod基因缺失菌株和互补菌株的生物学特性研究  44-46
    2.3.22 mod基因对细菌毒力的影响  46-47
    2.3.23 Agilent基因表达谱芯片(双标)制备与分析  47-51
3 结果与分析  51-70
  3.1 猪链球菌2型mod基因缺失菌株和互补菌株的筛选与鉴定  51-54
    3.1.1 猪链球菌2型mod基因缺失菌株的构建及PCR鉴定  51
    3.1.2 猪链球菌2型mod基因缺失菌株的PCR鉴定  51-52
    3.1.3 mod基因缺失菌株的Southern blot鉴定  52-53
    3.1.4 mod基因互补菌株的构建及PCR鉴定  53
    3.1.5 mod基因互补菌株的功能鉴定  53-54
  3.2 猪链球菌2型mod基因缺失菌株和互补菌株的生长特性试验  54-55
  3.3 野生株,突变株和互补菌株的形态结构比较  55-57
    3.3.1 革兰氏染色比较  55
    3.3.2 扫描电子显微镜的观察(SEM)  55-56
    3.3.3 透射电子显微镜的观察(TEM)  56-57
  3.4 mod基因的缺失对细菌毒力的影响  57-59
    3.4.1 仔猪的感染试验  57-58
    3.4.2 竞争感染试验  58-59
  3.5 野生株SC-19和突变株△mod的表达谱差异分析  59-70
    3.5.1 RNA提取的质量检测  59-60
    3.5.2 野生株WT和突变株△mod的基因表达差异  60-70
4 讨论  70-72
  4.1 温敏型自杀性质粒pSET4s在突变株构建中的问题  70
  4.2 mod基因与猪链球菌2型致病性的关系  70-71
  4.3 进一步的工作设想  71-72
5 总结  72-73
参考文献  73-82
致谢  82

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