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山羊痘病毒基因缺失重组毒株的构建与生物学特性鉴定

作　者: 李春艳
导　师: 黎宗强
学　校: 广西大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 山羊痘病毒 同源重组 基因缺失 重组病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 41次
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内容摘要


山羊痘是一种急热性传染病,由山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引发,临床上以出现发热和全身起痘为典型特征,具有很高的发病率和死亡率。我国目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株来预防山羊痘,但其在我国部分省份尤其是南方部分地区的羊痘防疫过程中,发现存在有安全隐患,可产生诸多不良反应,如全身发痘、孕羊流产等。因此,有必要进一步研制更为安全有效的新型基因工程疫苗。本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等方面的技术和手段,以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为模板,分别设计4对引物,PCR扩增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15两个区域两侧共四个基因组片段,分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；运用分子技术,分别将两侧重组臂相连,并在两个重组臂中间插入报告基因EGFP和筛选基因gpt的表达盒,构建转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg；分别将转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg与GTPV AV41株共转染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),使其在细胞内发生同源重组,加压筛选并纯化重组GTPV；最后鉴定重组GTPV和检测其生物学特性。通过一系列实验研究,确定了GTPV基因组中的两个病毒复制非必需区,分别成功构建了敲除掉GTPV毒力相关基因ORF5～ORF19之间共15个ORF和ORF149～ORF151之间共3个ORF的两株重组山羊痘弱毒株。同时证实这两个基因重组缺失毒株均可稳定遗传,并保持了亲本毒株在细胞培养物中的生长特性。这为研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基础,并为开发羊痘活载体疫苗提供了理想的载体。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩略词表  9-10
目录  10-12
前言  12-13
第一章 文献综述  13-25
  1.1 GTPV的流行概况  13
  1.2 病原学  13-16
    1.2.1 病毒的分类及形态  13-14
    1.2.2 病毒的理化特性  14
    1.2.3 基因组结构  14-16
  1.3 GTPV的诊断方法  16-19
    1.3.1 临床诊断  16-17
    1.3.2 实验室诊断  17-19
  1.4 GTPV缺失重组病毒的构建与筛选  19-21
    1.4.1 转移载体的构建元件  19-20
    1.4.2 缺失重组病毒的构建  20-21
    1.4.3 缺失重组毒的筛选  21
  1.5 羊痘疫苗的研究概况  21-23
    1.5.1 灭活疫苗  21-22
    1.5.2 弱毒疫苗  22
    1.5.3 亚单位疫苗  22
    1.5.4 活载体疫苗和基因缺失疫苗  22-23
  1.6 本研究的目的与意义  23-25
第二章 材料与方法  25-40
  2.1 材料  25-27
    2.1.1 质粒载体  25
    2.1.2 病毒与细胞  25
    2.1.3 主要试剂及其配制  25-26
    2.1.4 主要仪器设备  26
    2.1.5 引物设计  26-27
  2.2 方法  27-40
    2.2.1 原代犊牛睾丸(bovine testicle,BT)细胞的制备  27-28
    2.2.2 GTPV的增殖  28
    2.2.3 病毒DNA的提取  28-29
    2.2.4 同源重组臂的克隆与鉴定  29-33
    2.2.5 转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg的构建及鉴定  33-37
    2.2.6 重组病毒vLF-Eg和vRF-Eg的制备、纯化和鉴定  37-38
    2.2.7 重组病毒的生物学特性鉴定  38-40
第三章 实验结果  40-48
  3.1 同源重组臂基因片段的克隆和序列分析结果  40-41
    3.1.1 同源重组基因片段的克隆结果  40
    3.1.2 扩增片段的核苷酸同源性分析结果  40-41
  3.2 中间转移载体PLF和PRF的鉴定结果  41-42
  3.3 重组转移载体质粒的构建鉴定结果  42
  3.4 重组病毒vLF-EG和vRF-EG的制备、纯化及PCR鉴定结果  42-43
  3.5 重组病毒的生物学特性鉴定  43-48
    3.5.1 重组病毒与亲本病毒的TCID_(50)比较结果  43-46
    3.5.2 重组病毒在BT细胞上的生长动力学  46
    3.5.3 重组病毒的遗传稳定性  46-48
第四章 讨论  48-52
  4.1 GTPV基因工程减毒疫苗的研究  48
  4.2 GTPV ORF5～ORF19和ORF149～ORF151区域的分子背景分析  48-50
  4.3 培养细胞的选择  50
  4.4 基因缺失重组毒株的鉴定  50-52
第五章 结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
攻读学位期间发表论文情况  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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