学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

迟缓爱德华氏菌高效疫苗的设计、构建以及免疫机制研究

作　者: 孙云
导　师: 孙黎
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 迟缓爱德华氏菌 亚单位疫苗 减毒疫苗 DNA疫苗 交叉保护疫苗 免疫机制
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 6次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


细菌性疾病是水产养殖业的重要疾病。迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性菌，能够感染多种经济鱼类并引起爱德华氏菌病，给水产养殖业造成巨大的经济损失。本论文主要是以牙鲆为实验动物，开展高效迟缓爱德华氏菌疫苗的设计与构建研究，并且探讨相关疫苗的免疫机制。具体如下：首先通过理论推断与实际实验相结合，本研究筛选出一系列迟缓爱德华氏菌免疫保护原，包括Esa1、Eta2、Eta1等，并在此基础上构建了基于细菌传递的重组亚单位疫苗、DNA疫苗、减毒疫苗和交叉保护疫苗。（1）基于Esa1构建重组亚单位疫苗、细菌传递的亚单位疫苗和DNA疫苗：Esa1是一个含有795个氨基酸残基的迟缓爱德华氏菌表面抗原，含有多个细菌表面抗原的保守位点且定位于迟缓爱德华氏菌的外膜。我们将Esa1在大肠杆菌中表达，获得了重组亚单位疫苗，发现其对迟缓爱德华氏菌引起的牙鲆感染有82%的免疫保护效应。随后我们利用肠道共生菌FP3构建了表面展示Esa1的细菌传递疫苗FP3/pJsa1。发现FP3/pJsa1作为口服微粒疫苗和注射疫苗分别能达到52%和79%的相对免疫保护率。我们进一步以Esa1为抗原，构建成了DNA疫苗pCEsa1。pCEsa1免疫牙鲆1个月和2个月后，其免疫保护率分别达到75%和71%。这些结果表明Esa1作为重组亚单位疫苗、鱼类肠道共生菌传递的表面展示型亚单位疫苗以及DNA疫苗皆具有良好的保护效应。（2）基于Eta2构建重组亚单位疫苗和DNA疫苗：在鱼类疫苗研究中，疫苗的免疫机制以及不同类型疫苗的免疫比较研究十分缺乏。本研究筛选得到一个新的迟缓爱德华氏菌免疫保护原Eta2，研究了Eta2作为重组亚单位疫苗和DNA疫苗所诱发的免疫保护效应及免疫机制。我们发现Eta2作为重组亚单位疫苗在免疫牙鲆4周和8周后，可分别产生83%和78%的相对保护率；作为DNA疫苗在免疫牙鲆4周和8周后产生的相对保护率分别为67%和68%。免疫学研究表明此两类疫苗均可增强牙鲆头肾巨噬细胞的杀菌活性、引起特异性和非特异性免疫相关基因上调，以及刺激牙鲆产生特异性抗体，其中亚单位疫苗诱发产生的抗体水平较高。进一步研究表明，Eta2作为重组亚单位疫苗主要引起牙鲆的体液免疫，而作为DNA疫苗则同时引起了鱼体B细胞和T细胞的免疫应答。这些结果说明Eta2是良好的免疫保护原，可以作为重组亚单位疫苗和DNA疫苗激发宿主的免疫保护反应，但是不同形式疫苗的免疫机制存在差异。（3）毒力因子Eta1及其免疫保护作用：在本研究中，我们发现了一个与细菌黏附素有同源性的体内诱导抗原Eta1。eta1基因在迟缓爱德华氏菌未侵染宿主时，其表达依赖于细菌的生长周期，而当迟缓爱德华氏菌侵染宿主时，eta1的mRNA水平显著上升。将eta1缺失突变后，缺失菌株在细胞和组织水平的侵染能力显著下降，说明Eta1是迟缓爱德华氏菌侵染所需的一个毒力因子。我们构建了Etal的重组亚单位疫苗rEta1，发现其能够诱导牙鲆产生高达83.3%的免疫保护率。rEtal免疫牙鲆后能够诱导鱼类产生特异性抗体，这些抗体在迟缓爱德华氏菌感染后能与表达于细菌表面的Eta1相结合。（4）减毒疫苗的构建以及疫苗导入途径研究：本研究筛选得到一株迟缓爱德华氏菌的弱毒菌株TX5RM，利用该弱毒菌株作为减毒疫苗，探索了注射、口服、浸泡及口服浸泡叠加等不同导入方式对疫苗免疫保护效应的影响。结果表明，这四种免疫方式均产生了明显的免疫保护效应，其中以口服与浸泡叠加的方式效果最为显著，在免疫牙鲆5周和8周后的相对保护率分别达到了80.6%和69.4%。（5）口服/浸泡DNA疫苗及其交叉免疫保护效应：我们将上述TX5RM作为DNA疫苗的导入载体，构建了携带海豚链球菌DNA疫苗pCS10的迟缓爱德华氏菌减毒疫苗TX5RMS10。免疫牙鲆后，TX5RMS10携带的DNA疫苗质粒能够在鱼体中稳定存在并表达海豚链球菌抗原Sia10。TX5RMS10经口服和浸泡方式免疫牙鲆1个月和2个月后，用迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌分别攻毒，发现免疫组具有高达69~83%的存活率。这些结果说明TX5RMS10是一个高效的候选疫苗，其具有TX5RM和pCS10的免疫原性，因此可以诱导针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉免疫保护效应。另外，该疫苗能够通过模拟自然感染的方式导入鱼体，从而避免了常规DNA疫苗的注射导入，因此在应用上具有非常好的优势。综上所述，本论文研究建立了新型鱼类疫苗的构建技术和导入方法，获得了多种不同类型的高效疫苗，初步阐明了不同类型疫苗诱发的免疫反应机制。这些研究结果促进了迟缓爱德华氏菌疫苗研究的发展，为鱼类迟缓爱德华氏菌病的防控提供了新思路。

全文目录


致谢  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-16
第一章 前言  16-26
  1.1 病原菌  16-23
    1.1.1 迟缓爱德华氏菌简介  16
    1.1.2 迟缓爱德华氏菌分类、生化特征与分布  16-18
    1.1.3 迟缓爱德华氏菌病鱼类症状及鉴定  18-19
    1.1.4 毒力因子和致病机制  19-21
    1.1.5 Ⅲ型分泌系统和Ⅵ型分泌系统（T3SS 和 T6SS）  21-23
  1.2 疫苗  23-26
第二章 迟缓爱德华氏菌表面抗原 Esa1  26-48
  2.1 引言  26-28
  2.2 鱼类肠道共生菌传递重组亚单位疫苗 FP3/pJsa1 的构建及免疫效应研究  28-38
    2.2.1 材料与方法  28-31
      2.2.1.1 菌株和生长条件  28
      2.2.1.2 克隆 esa1  28
      2.2.1.3 质粒和菌株的构建  28-29
        2.2.1.3.1 pETEsa1 的构建  28
        2.2.1.3.2 FP3/pJsa1 和 FP3/pJT 菌株的构建  28-29
      2.2.1.4 重组蛋白的表达及纯化  29
      2.2.1.5 牙鲆  29
      2.2.1.6 免疫  29-30
      2.2.1.7 酶联免疫吸附测定法  30
      2.2.1.8 被动免疫  30
      2.2.1.9 蛋白质免疫印迹分析  30-31
      2.2.1.10 凝集实验  31
      2.2.1.11 FP3/pJsa1 在免疫鱼体中的克隆和扩散  31
      2.2.1.12 统计学分析  31
    2.2.2 结果  31-36
      2.2.2.1 esa1 的序列特性  31-32
      2.2.2.2 Esa1 作为重组亚单位疫苗的免疫保护效果  32
      2.2.2.3 rEsa1 引起的血清抗体反应  32-33
      2.2.2.4 rEsa1 抗血清引起的被动免疫  33
      2.2.2.5 构建表达表面蛋白 Esa1 的共生菌株  33-34
      2.2.2.6 FP3/pJsa1 作为口服疫苗和注射疫苗的免疫反应  34-35
      2.2.2.7 口服 FP3/pJsa1 在牙鲆各组织中的存活及扩散  35-36
    2.2.3 讨论  36-38
  2.3 迟缓爱德华氏菌 DNA 疫苗 pCEsa1 的构建及免疫机制研究  38-48
    2.3.1 材料与方法  38-41
      2.3.1.1 菌株生长条件  38
      2.3.1.2 质粒的构建  38
      2.3.1.3 牙鲆  38
      2.3.1.4 免疫  38-39
      2.3.1.5 PCR 检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体中的存在  39
      2.3.1.6 逆转录 PCR（RT-PCR）检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体中的表达  39
      2.3.1.7 荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析免疫相关基因的表达  39
      2.3.1.8 免疫胶体金检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体内表达  39-40
      2.3.1.9 DNA 疫苗 pCEsa1 对巨噬细胞的免疫活性的影响  40-41
        2.3.1.9.1 头肾巨噬细胞的提取  40
        2.3.1.9.2 呼吸爆发  40
        2.3.1.9.3 酸性磷酸酶活性  40
        2.3.1.9.4 杀菌活性  40-41
      2.3.1.10 血清杀菌实验  41
      2.3.1.11 酶联免疫吸附测定法  41
      2.3.1.12 被动免疫  41
      2.3.1.13 数据分析  41
    2.3.2 结果  41-46
      2.3.2.1 pCEsa1 的免疫保护效应  41-43
        2.3.2.1.1 Esa1 在免疫鱼肌肉中的表达  41-43
        2.3.2.1.2 pCEsa1 的免疫保护  43
      2.3.2.2 pCEsa1 引起的免疫效应  43-46
        2.3.2.2.1 巨噬细胞活性  43-44
        2.3.2.2.2 血清杀菌活性  44
        2.3.2.2.3 血清抗体反应及其对免疫保护作用的重要性  44-45
        2.3.2.2.4 免疫相关基因的表达  45-46
    2.3.3 讨论  46-48
第三章 迟缓爱德华氏菌重组亚单位疫苗 rEta2 和 DNA 疫苗 pCEta2 免疫保护效应及免疫机制比较研究  48-59
  3.1 引言  48-49
  3.2 材料和方法  49-51
    3.2.1 细菌菌株和生长条件  49
    3.2.2 eta2 的克隆  49
    3.2.3 质粒构建和准备  49
    3.2.4 重组蛋白的表达及纯化  49
    3.2.5 牙鲆  49-50
    3.2.6 免疫保护实验  50
    3.2.7 PCR 检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体中的存在  50
    3.2.8 逆转录 PCR （RT-PCR）检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体中的表达  50
    3.2.9 免疫胶体金检测 DNA 疫苗在免疫牙鲆鱼体内表达  50
    3.2.10 荧光定量 PCR （qRT-PCR）分析免疫相关基因的表达  50
    3.2.11 巨噬细胞免疫活性  50-51
      3.2.11.1 呼吸爆发  50-51
      3.2.11.2 酸性磷酸酶活性  51
    3.2.12 酶联免疫吸附测定法  51
    3.2.13 被动免疫  51
    3.2.14 数据分析  51
    3.2.15 数据搜索  51
  3.3 结果  51-57
    3.3.1 Eta2 序列特征  51
    3.3.2 Eta2 重组亚单位疫苗免疫保护效应  51-53
    3.3.3 Eta2 作为 DNA 疫苗的免疫效应  53-54
      3.3.3.1 Eta2 在免疫鱼体组织中的表达  53-54
      3.3.3.2 pCEta2 引起的免疫反应  54
    3.3.4 rEta2 和 pCEta2 引起的免疫反应  54-57
      3.3.4.1 巨噬细胞活性  54-55
      3.3.4.2 血清抗体的产生  55-56
      3.3.4.4 免疫相关基因的表达  56-57
  3.4 讨论  57-59
第四章 迟缓爱德华氏菌减毒疫苗  59-78
  4.1 前言  59-60
  4.2 迟缓爱德华氏菌减毒疫苗 TX5RM 的构建与评价  60-69
    4.2.1 材料与方法  60-63
      4.2.1.1 菌株及生长条件  60
      4.2.1.2 分离 TX5RM  60-61
      4.2.1.3 菌株毒力分析  61
      4.2.1.4 全细胞蛋白分析  61
      4.2.1.5 牙鲆  61
      4.2.1.6 免疫  61-63
      4.2.1.7 酶联免疫吸附测定法  63
      4.2.1.8 数据分析  63
    4.2.2 结果  63-67
      4.2.2.1 TX5 野生型与利福平突变菌株 TX5RM 生长状况与蛋白产物的比较  63-64
      4.2.2.2 TX5 野生型与利福平突变菌株 TX5RM 毒力方面的比较  64-65
      4.2.2.3 TX5RM 作为潜在的注射型疫苗  65
      4.2.2.4 TX5RM 作为潜在的口服疫苗和浸泡疫苗  65-66
      4.2.2.5 TX5RM 作为口服疫苗和浸泡疫苗在组织中的扩散  66-67
      4.2.2.6 TX5RM 产生的血清抗体反应  67
    4.2.3 讨论  67-69
  4.3 迟缓爱德华氏菌减毒疫苗 TX5RM 传递海豚链球菌 DNA 疫苗的新型交叉疫苗  69-78
    4.3.1 材料和方法  69-72
      4.3.1.1 菌株和生长条件  69
      4.3.1.2 TX5RMS10 和 TX5RMpCN3 的构建  69-70
      4.3.1.3 牙鲆  70
      4.3.1.4 免疫  70-71
      4.3.1.5 TX5RMS10 的组织入侵能力和基因稳定性分析  71-72
      4.3.1.6 DNA 疫苗在鱼组织中的表达  72
      4.3.1.7 酶联免疫吸附测定法  72
      4.3.1.8 荧光定量 PCR （qRT-PCR）分析免疫相关基因的表达  72
      4.3.1.9 数据分析  72
    4.3.2 结果和讨论  72-78
      4.3.2.1 TX5RMS10 对牙鲆组织的侵染能力和遗传稳定性研究  72-73
      4.3.2.2 DNA 疫苗在鱼类组织中的表达情况  73-75
      4.3.2.3 TX5RMS10 诱导交叉保护作用的研究  75
      4.3.2.4 TX5RMS10 诱导的免疫应答  75-77
      4.3.2.5 结论  77-78
第五章 多价灭活疫苗的构建及免疫效果评价  78-86
  5.1 前言  78-79
  5.2 材料和方法  79-80
    5.2.1 牙鲆  79
    5.2.2 免疫准备  79-80
    5.2.3 免疫  80
    5.2.4 酶联免疫反应分析  80
    5.2.5 血清杀菌试验  80
    5.2.7 数据分析  80
  5.3 结果和讨论  80-86
    5.3.1 四种单价灭活全菌疫苗及四价疫苗的保护效应  80-82
    5.3.2 三价和二价疫苗的保护效应  82
    5.3.3 血清抗体反应与杀菌实验  82-84
    5.3.4 迟缓爱德华和鳗弧菌病原菌的交叉酶联免疫反应和杀菌活性  84-85
    5.3.5 小结  85-86
第六章 迟缓爱德华氏菌基因 eta1 的功能研究  86-101
  6.1 前言  86-87
  6.2 材料与方法  87-91
    6.2.1 菌株和生长条件  87
    6.2.2 用于感染实验的牙鲆  87
    6.2.3 克隆 eta1 并且进行序列分析  87
    6.2.4 牙鲆头肾淋巴细胞提取  87
    6.2.5 qRT-PCR 分析法检测 eta1 基因表达  87-88
    6.2.6 质粒和菌株构建  88
    6.2.7 重组蛋白纯化与蛋白抗体制备  88
    6.2.8 Eta1 蛋白亚细胞定位  88-89
      6.2.8.1 免疫印迹反应  88-89
      6.2.8.2 免疫荧光实验  89
    6.2.9 组织侵染及致死率分析  89
    6.2.10 爱德华氏菌侵染宿主细胞实验  89-90
    6.2.11 qRT-PCR 分析爱德华氏菌侵染牙鲆免疫基因表达情况  90
    6.2.12 牙鲆淋巴细胞与 rEta1 的交互作用  90
    6.2.13 抗 rEta1 蛋白抗体对爱德华氏菌侵染的影响  90
    6.2.14 免疫实验  90-91
    6.2.15 酶联免疫吸附测定法  91
    6.2.16 数据分析  91
    6.2.17 核酸序列登记编号  91
  6.3 结果  91-98
    6.3.1 Etal 序列特征  91
    6.3.2 eta1 在体外以及感染过程中的表达分析  91-92
    6.3.3 Etal 的亚细胞定位  92-94
    6.3.4 Etal 突变的效应  94-97
      6.3.4.1 对组织扩散以及基本细菌毒力的影响  94-95
      6.3.4.2 TXetal 对宿主细胞以及细胞免疫反应的影响  95-97
    6.3.5 重组 rEta1 与牙鲆淋巴细胞结合  97
    6.3.6 Etal 抗体对 E.tarda 感染的影响  97-98
    6.3.7 rEta1 的免疫保护效应  98
  6.4 讨论  98-101
创新性及科学意义  101-102
参考文献  102-122
附录  122-128
作者简历  128-129
博士期间发表的文章及申请的专利  129-130

相似论文

  1. 猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究,S858.28
  2. 乙型脑炎病毒NS1蛋白的新型prime-boost免疫策略研究,R392
  3. 霍乱毒素A、B亚单位对HIV-1调节/辅助基因DNA疫苗的佐剂效应研究,R392
  4. 哈维氏弧菌毒性相关质粒的结构解析及迟缓爱德华氏菌磷脂酶D的初步研究,S941
  5. 日本血吸虫DNA疫苗在小鼠体内的代谢及时空表规律研究,S855.91
  6. pcDNA3.1（+）/ICP27重组HSV-2DNA疫苗的构建及在真核细胞中的表达,R392
  7. 用于防龋DNA疫苗粘膜传递的有效载体的研究,R392.1
  8. 表达融合蛋白CFP21-MPT64和ESAT-6-CFP10的DNA疫苗增强BCG初免小鼠抗结核病的保护性,R392
  9. App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究,S858.28
  10. 小儿呼吸道人类博卡病毒感染免疫致病机制的初步研究,R725.6
  11. 猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗的构建及间接ELISA方法的建立,S858.28
  12. 牛结核病三价DNA疫苗制备工艺研究及免疫效果初步评价,S858.23
  13. 羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析,S858.26
  14. 细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶免疫保护力观察及其免疫机制的研究,R392
  15. 鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验,S858.31
  16. 卡氏肺孢子菌p55基因片段DNA疫苗免疫保护作用的研究,R392.1
  17. 细粒棘球蚴（中国大陆株）重组抗原Eg14-3-3免疫保护力及免疫机制的研究,R392
  18. 重组细粒棘球蚴亲肌肉抗原抗小鼠感染细粒棘球蚴的免疫保护性及其机制研究,R392
  19. 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗保护力及其免疫机制研究,R392
  20. 哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompU的克隆表达、DNA疫苗构建及对大菱鲆免疫效果探究,S941
  21. 减毒沙门氏菌介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因疫苗的构建及其小鼠免疫试验研究,S858.28

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
© 2012 www.xueweilunwen.com