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羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析

作　者: 芦晓立
导　师: 张强；孙晓林
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 羊痘病毒 P32基因 CD58基因 DNA疫苗
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

羊痘是由羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,是所有动物痘病中最为重要的一种。由该病毒引起的疾病在1997年被世界动物卫生组织(OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一,我国也将其列为一类动物疾病。羊痘病毒P32蛋白是位于羊痘病毒囊膜表面的主要结构蛋白,含有主要的抗原表位。CD58即淋巴细胞功能相关抗原-3,与CD2结合既可使免疫系统处于激活状态。本文旨在将羊痘病毒抗原基因和CD58基因构建在同一载体上,发挥CD58的免疫佐剂作用,以增强表达P32蛋白的免疫效果,为进一步开发高效的DNA疫苗奠定基础。本实验从健康的羊的血液中分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增羊致敏淋巴细胞中的CD58基因,将CD58基因插入pGEX-4T-1载体,构建了能够表达CD58的原核表达载体pGEX-CD58。经ITPG诱导,目的基因在大肠杆菌中得到表达,表达蛋白质分子量为53ku。经鉴定能与羊CD58的单克隆抗体发生反应,说明表达产物具有反应原性。从羊痘组织病变中扩增得到P32基因,与pBudCE4.1载体连接,构建的质粒pBudCE4.1 /P32 ,与此前获得的CD58基因共同构建重组质粒pBudCE4.1/CD58/P32。质粒提纯后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别检测P32和CD58在BHK-21中的表达。结果显示,P32和CD58在BHK-21细胞中都得到表达。以BALB/c小鼠为动物模型,通过肌肉注射接种免疫BALB/c小鼠,定期采血用ELISA法检测免疫抗体水平;用MTT法检测细胞免疫情况,结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。

全文目录

摘要  3-4
Summary  4-9
第一章文献综述  9-29
  1.1 羊痘的研究进展  9-18
    1.1.1 羊痘的流行概况  9
    1.1.2 羊痘病毒的基本特征  9-10
    1.1.3 羊痘病毒基因组结构  10-11
    1.1.4 羊痘病毒的P32 结构蛋白  11-12
    1.1.5 羊痘诊断技术研究  12-14
    1.1.6 羊痘免疫技术研究  14-18
  1.2 DNA疫苗免疫佐剂的研究进展  18-29
    1.2.1 共刺激分子  18-21
    1.2.2 细胞因子  21-25
    1.2.3 CpG DNA 基序  25-26
    1.2.4 脂质体  26-27
    1.2.5 研究目的和意义  27-29
第二章羊 CD58 的克隆与表达  29-45
  2.1 材料  29-32
    2.1.1 菌种和载体  29
    2.1.2 主要试剂  29
    2.1.3 采样动物  29
    2.1.4 引物  29
    2.1.5 溶液和试剂  29-31
    2.1.6 仪器与设备  31-32
  2.2 方法  32-40
    2.2.1 淋巴细胞的分离  32
    2.2.2 细胞总RNA 抽提  32-33
    2.2.3 RT-PCR 扩增CD58 基因  33-34
    2.2.4 CD58 基因的纯化回收  34-35
    2.2.5 目的基因的克隆  35-37
    2.2.6 重组表达载体的构建  37-38
    2.2.7 重组表达质粒的诱导表达  38
    2.2.8 表达产物的检测  38-40
  2.3 结果  40-43
    2.3.1 绵羊CD58 基因克隆  40
    2.3.2 重组表达载体pGEX-CD58 的PCR 及酶切鉴定  40-42
    2.3.3 羊CD58 表达产物的SDS-PAGE  42-43
    2.3.4 羊CD58 表达产物的Western-bloting 检测  43
  2.4 讨论  43-45
第三章羊痘 P32基因与羊 CD58基因共表达质粒的构建  45-63
  3.1 材料  45-47
    3.1.1 菌种和载体  45
    3.1.2 主要试剂  45
    3.1.3 实验毒株  45
    3.1.4 引物  45-46
    3.1.5 溶液与试剂  46-47
    3.1.6 仪器与设备  47
  3.2 方法  47-57
    3.2.1 羊痘病毒P32 基因的克隆  47-52
    3.2.2 共表达载体的构建  52-54
    3.2.3 共表达载体在BHK 细胞中的表达  54-55
    3.2.4 共表达载体的动物试验  55
    3.2.5 间接ELISA 试验检测体液免疫  55-56
    3.2.6 MTT 试验检测细胞免疫  56-57
  3.3 结果  57-61
    3.3.1 羊痘病毒P32 基因的克隆  57
    3.3.2 pBudCE4.1/CD58/P32 重组质粒的酶切鉴定  57-58
    3.3.3 共表达载体质粒的大量提取  58
    3.3.4 共表达载体在BHK 细胞中的表达  58-59
    3.3.5 共表达载体的动物实验  59-61
  3.4 讨论  61-63
    3.4.1 关于共表达载体构建的问题  61
    3.4.2 关于动物实验的问题  61-63
第四章全文结论  63-64
参考文献  64-72
致谢  72-73
作者简介  73-74
导师简介  74-75

羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析

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