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鲁氏耶尔森氏菌p1基因的克隆、分子特性分析及原核表达

作　者: 连海
导　师: 汪开毓
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 鲁氏耶尔森氏菌 p1基因 克隆 生物信息学分析 原核表达
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 24次
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内容摘要


鲁氏耶尔森氏菌是一种危害世界水产养殖业的条件致病菌。Yrp1蛋白作为该菌的重要毒力因子之一,对于其致病性相当重要。然而,该蛋白在生物信息学分析方面的研究数据还未见报道。为了填补Yrp1蛋白及其编码基因在生物信息学研究方面的空白,为进一步研究其相关功能和作用机理提供理论依据,本研究根据GenBank中公布的鲁氏耶尔森氏菌p1基因(yrp1)序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增出yrp1基因,并将其连接到克隆载体pMD19-T进行测序,然后对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析；之后将重组质粒pMD19-T-yrpl双酶切、连接表达载体pET-32a(+)并转化BL21(DE3)表达宿主菌,IPTG诱导表达并对诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度进行优化,以期为Yrp1蛋白质疫苗的规模化制备奠定基础。生物信息学分析结果显示,yrp1基因大小为1434bp,含有一个完整的ORF,编码的蛋白质含有477个氨基酸,相对分子量理论值为51.5kDa,等电点理论值为4.48,分子式为C2284H3422N608O742S8。蛋白质中含量较高的氨基酸为Gly和Ser,含量较低的氨基酸为Trp、Met和Cys,不含有Pyl和Sec。其中,疏水氨基酸230个,占氨基酸总数的48.2%,亲水性氨基酸有247个,占51.8%；酸性氨基酸55个,占11.5%,碱性氨基酸28个,占5.9%。该蛋白包含1个保守结构域,为ZnMc超家族结构域,系统进化树分析表明,Yrp1蛋白与鲁氏耶尔森氏菌沙雷氏菌溶素(基因登录号ZP04616595)亲缘关系最近。疏水性预测分析结果显示,Yrp1多肽链的亲水区大于疏水区；但是重组蛋白溶解度预测结果表明,当选择大肠杆菌为表达宿主菌进行诱导表达时,Yrp1重组蛋白的溶解度仅为35.9%。Yrp1蛋白共有35个潜在的磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点。该蛋白位于胞外,为分泌蛋白,但是没有信号肽。二级结构预测结果显示Yrp1蛋白中无规则卷曲比例较大,高达52.62%,β-折叠为25.58%,α-螺旋为17.4%；三级结构预测结果显示,Yrp1蛋白三维构象主要包含无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋。密码子偏爱性分析结果显示,yrp1基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与酵母和大肠杆菌较为接近。诱导表达结果显示,重组质粒经IPTG诱导后,表达出约72kDa的融合蛋白,主要以包涵体的形式大量存在与沉淀中。对诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度进行优化,结果显示,诱导表达的最佳条件为IPTG浓度0.8mmol/L,37℃诱导表达4h。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-7
英文缩写中英文对照表  7-10
文献综述  10-18
  1. 病原  10-14
    1.1 鲁氏耶尔森氏菌的分类学地位  10
    1.2 鲁氏耶尔森氏菌的特征  10-11
    1.3 鲁氏耶尔森氏菌菌株分型  11
    1.4 致病机理  11-13
    1.5 主要毒力因子  13-14
  2 临床症状及病理变化  14-15
  3 诊断  15
  4 免疫预防  15-17
    4.1 免疫机制  15-16
    4.2 疫苗  16-17
  5 药物治疗  17-18
本研究的目的和意义  18-19
第一节 Yrp1基因的克隆、鉴定及生物信息学分析  19-35
  1 实验材料  19-20
    1.1 菌株及载体  19
    1.2 主要试剂  19
    1.3 主要溶液及培养基的配置  19-20
    1.4 主要仪器设备  20
    1.5 主要生物信息学分析软件  20
  2 实验方法  20-23
    2.1 引物设计  20
    2.2 鲁氏耶尔森氏菌基因组DNA的提取  20
    2.3 Yrp1基因克隆及测序  20-22
    2.4 Yrp1基因的分子特性分析  22-23
    2.5 Yrp1蛋白质序列分子特性分析  23
  3. 结果  23-33
    3.1 Yrp1基因的PCR扩增和T-克隆鉴定  23-24
    3.2 重组质粒测序、比对及ORF分析  24-25
    3.3 Yrp1蛋白的分子特性分析  25-33
  4. 讨论  33-35
    4.1 Yrp1基因的引物设计和T-克隆  33
    4.2 蛋白质序列的生物信息学分析  33-34
    4.3 密码子偏爱性对基因表达的影响  34-35
第二节 PET-32a(+)-yrp1表达载体的构建及表达条件的优化  35-46
  1. 试验材料  35-37
    1.1 菌株及载体  35
    1.2 主要试剂  35-36
    1.3 主要溶液及培养基的配置  36-37
    1.4 主要仪器设备  37
  2. 试验方法  37-39
    2.1 Yrp1基因亚克隆  37-38
    2.2 重组质粒诱导表达  38-39
    2.3 诱导条件的优化  39
  3. 结果  39-43
    3.1 重组质粒pET-32a(+)-yrp1的酶切鉴定  39-40
    3.2 重组蛋白在宿主菌中的分布  40-41
    3.3 IPTG浓度优化  41-42
    3.4 诱导时间优化  42-43
    3.5 诱导温度优化  43
  4. 讨论  43-46
    4.1 融合表达的意义  43-44
    4.2 影响表达的因素  44
    4.3 诱导条件的优化  44-45
    4.4 包涵体的形成及优点  45-46
结论与创新  46-47
  1. 结论  46
  2. 创新  46-47
参考文献  47-54
致谢  54-55
攻读学位期间发表的学术论文  55

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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