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养殖大菱鲆肠道微生物多样性及功能分析

作　者: 邢孟欣
导　师: 刘斌
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 大菱鲆肠道宏基因组 16SrRNA 培养效率
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本课题是利用分子手段和传统培养手段对养殖大菱鲆肠道菌群结构及功能特征进行研究。首先，利用宏基因组测序技术及16S rRNA分析技术对大菱鲆肠道菌群结构进行研究，共得到33,998条拼接序列（contigs）和95条操作分类单元序列（OTUs）。研究结果显示在大菱鲆肠道中变形菌门与厚壁菌门所占的比例最高（95%），且存在于肠道粘膜和内含物中。进一步将大菱鲆肠道菌群按照属来划分可知，弧菌属所占的比例最大，且存在于大菱鲆肠道的各个部分中，尤其在直肠内含物中所占比例最大。弧菌属中的四个主要类群，包括哈氏弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌以及副溶血弧菌，均被认为是海水鱼类的潜在致病菌。与其他物种肠道菌群结构相比，大菱鲆肠道中含有较高比例的-变形菌纲和柔膜菌纲，弧菌属和支原体属分别在这两个纲中占优势地位。16S rRNA基因序列分析结果显示，大菱鲆肠道各部分菌群的多样性是逐渐降低的（从胃到直肠），且大菱鲆肠道中的某些菌群可能来源于周围海水环境。其次，为了能够提高培养效率，本课题选择了18种固体培养基对大菱鲆肠道菌群进行培养，包括8种基础培养基，8种1%肠道上清培养基以及2%、4%肠道上清培养基。结果共得到1,711个菌落和24个OTUs，其中Zobell2216E/Zobell2216E+固体培养基中分离的菌落数和菌群多样性最高，而MRS/MRS+固体培养基中的培养结果最不理想。含有肠道上清的培养基（1%、2%、4%）中的菌群结构与基础培养基中的菌群结构存在差异，且肠道上清中可能存在某些物质能够提高大菱鲆肠道菌群的培养效率。对培养得到的菌落进行分类分析可知，-变形菌门所占的比例最大（82%），其次是厚壁菌门和放线菌门（分别为15.6%和2.4%）。进一步按照属来划分可知，弧菌属所占比例最大（49.4%）。此外，还检测到许多潜在的致病菌和益生菌。致病菌包括假单胞菌属、发光菌属以及肠杆菌属。益生菌包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属以及希瓦氏菌属。另外，培养实验所得到的大多数OTUs均是首次在大菱鲆肠道中报道，这些细菌在大菱鲆肠道中的作用还需进一步研究。最后，本课题对大菱鲆肠道宏基因组拼接数据进行功能分析。结果显示，Clustering-based subsystems所占比例最大，约占大菱鲆肠道宏基因组拼接数据的15.9%，此外，与代谢相关的功能也占有较高比例。利用比较宏基因组学方法分析不同物种肠道宏基因组可知，在大菱鲆肠道宏基因组数据中与群体感应及生物膜形成系统相关的基因所占的比例较大，且这些基因均来源于弧菌属，包括创伤弧菌、霍乱弧菌以及副溶血弧菌。在养殖鱼类肠道宏基因组中，与压力应答以及蛋白折叠系统相关的基因所占比例较高，此外还检测到一些抗生素抗性以及重金属抗性基因。这些数据证明大菱鲆肠道微生物可能受到了养殖过程中某些人为因素的影响，从而产生相应的特殊功能。另外，与淡水鱼（杂交条纹鲈鱼）肠道宏基因组相比，大菱鲆肠道宏基因组中铁元素吸收及代谢系统所占的比例较大，这证明在海洋动物中可能存在着特有的代谢功能。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-32
  1.1 鱼类肠道生态系统中宿主与微生物的相互作用  12-20
    1.1.1 肠道中宿主与微生物的相互交流  12-16
    1.1.2 益生菌  16-20
  1.2 肠道微生物研究方法  20-27
    1.2.1 传统培养方法  21-24
    1.2.2 现代分子生物学技术  24-27
  1.3 鲽形目鱼研究进展  27-30
    1.3.1 鲽形目鱼的水产养殖  27-29
    1.3.2 鲽形目鱼基因组研究  29-30
  1.4 本课题的研究目的和意义  30-32
第二章养殖大菱鲆肠道菌群结构特征分析  32-53
  2.1 前言  32
  2.2 实验材料  32-34
    2.2.1 实验仪器及试剂  32-34
    2.2.2 样品采集  34
  2.3 实验方法  34-38
    2.3.1 养殖大菱鲆肠道微生物的富集  34-35
    2.3.2 养殖大菱鲆肠道微生物基因组 DNA 提取  35-36
    2.3.3 养殖大菱鲆肠道微生物宏基因组 Solexa 测序  36-37
    2.3.4 大菱鲆肠道微生物宏基因组测序数据的组装和分析  37-38
  2.4 实验结果  38-49
    2.4.1 大菱鲆肠道微生物基因组 DNA 提取结果  38-39
    2.4.2 宏基因组测序结果  39-42
    2.4.3 利用宏基因组数据分析大菱鲆肠道微生物结构组成  42-45
    2.4.4 比较宏基因组学研究大菱鲆肠道菌群结构特征  45-49
  2.5 讨论  49-52
  2.6 小结  52-53
第三章养殖大菱鲆肠道各个部分菌群结构特征以及环境的影响  53-74
  3.1 前言  53
  3.2 实验材料  53-55
    3.2.1 实验仪器及试剂  53-55
    3.2.2 样品采集  55
  3.3 实验方法  55-62
    3.3.1 大菱鲆肠道各部分以及养殖海水中微生物的富集  55-56
    3.3.2 大菱鲆肠道各个部分微生物基因组 DNA 提取  56
    3.3.3 大菱鲆肠道各个部分 16S rRNA 文库构建  56-60
    3.3.4 限制性片段多态性分析（RFLP）及测序数据分析  60-62
  3.4 实验结果  62-71
    3.4.1 微生物基因组 DNA 提取结果  62-63
    3.4.2 16S rRNA 基因序列 PCR 扩增结果  63
    3.4.3 16S rRNA 文库构建及 RFLP 分析结果  63-71
  3.5 讨论  71-73
  3.6 小结  73-74
第四章利用传统培养手段最大程度还原大菱鲆肠道菌群结构  74-91
  4.1 前言  74
  4.2 实验材料  74-77
    4.2.1 实验仪器及试剂  74-77
    4.2.2 样品采集  77
  4.3 实验方法  77-81
    4.3.1 大菱鲆肠道中微生物及肠道上清采集  77-78
    4.3.2 大菱鲆肠道中微生物的培养  78-79
    4.3.3 菌落 PCR、限制性片段多态性分析（RFLP）及测序数据分析  79-81
  4.4 实验结果  81-86
    4.4.1 培养基中菌落生长情况及比较分析  81-83
    4.4.2 肠道上清培养基与基础培养基中菌落生长情况比较  83-84
    4.4.3 大菱鲆肠道中可被培养的细菌分类结果  84-86
  4.5 讨论  86-90
  4.6 小结  90-91
第五章养殖大菱鲆肠道菌群功能分析  91-107
  5.1 前言  91
  5.2 实验材料  91
  5.3 实验方法  91-92
  5.4 实验结果  92-101
    5.4.1 大菱鲆肠道宏基因组数据功能分类  92-96
    5.4.2 比较分析各物种肠道宏基因组数据  96-101
  5.5 讨论  101-106
  5.6 小结  106-107
结论  107-109
参考文献  109-129
作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果  129

养殖大菱鲆肠道微生物多样性及功能分析

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