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叶尔羌高原鳅肝胰脏cDNA文库的构建及抗菌肽Hepcidin基因的克隆

作　者: 刘书东
导　师: 李莲瑞
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 叶尔羌高原鳅 抗菌肽hepcidin cDNA文库
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


叶尔羌高原鳅[Tr iplophysa (Hedinichthys) yarkandensis (Day)]主要分布新疆南部的塔里木河水系,其肝组织将胰脏、胰腺组织包裹于内,胰脏、胰腺组织分散于肝组织之中,与肝组织一起构成整个肝胰脏结构。它们各自独立地发挥着生理功能。在电镜下观察到肝细胞之间有着非常丰富的肝血窦和枯否氏细胞,是鱼类非常重要的免疫细胞,在鱼类非特异性免疫中发挥重要作用。本研究通过构建叶尔羌高原鳅肝胰脏cDNA文库可以筛选功能基因，如鱼类抗菌肽hepcidin、主要组织相容性复合体等。取文库样品进行普通PCR和降落式PCR扩增抗菌肽基因。结果：降落式PCR成功扩增出抗菌肤hepcidin基因(387bp)。通过GenBank数据库分析发现叶尔羌高原鳅抗菌肽hepcidin基因与黑棘鲷、小口黑鲈同源性达90%,在进化树可以看出黑棘鲷亲缘性最近。抗菌肽Hepcidin是一类由基因编码的小分子多肽,是机体免疫防卫系统的重要组成部分,生物体产生的对抗外源性病原体侵袭致病作用的防御性肽类活性物质。抗菌肽分子量小,活性强,功能广泛。其杀菌过程主要分为三个步骤：第一,抗菌肽α-螺旋上的正电荷与细菌细胞磷脂分子上的负电荷在静电力的作用下相互靠近；第二,借助于抗菌肽分子中N端与C端间的连续结构的柔性,它的疏水端插入质膜中,开始造成细菌细胞膜磷脂双分子结构的破坏；第三,抗菌肽分子的两亲性α-螺旋也插入质膜中,更深一步地破坏了脂质双分子层原有的有序结构,β-折叠的两亲性使得抗菌肽分子通过膜内分子而相互聚集在一起,在细菌细胞膜上形成离子通道,细菌最终不能保持正常渗透压,引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
前言  7-10
第一章 综述  10-22
  1.1 叶尔羌高原鳅的特征  10-12
  1.2 鱼类非特异性免疫  12-14
  1.3 抗菌肽的定义及抗菌机理  14-16
  1.4 鱼类抗菌肽  16-18
  1.5 cDNA文库构建  18-19
  1.6 cDNA文库构建的类型  19-20
  1.7 cDNA文库构建的原理  20-22
第二章 叶尔羌高原鳅肝胰脏cDNA文库的构建  22-38
  2.1 叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA的提取及纯化  23-26
    2.1.1 材料、试剂  23
    2.1.2 主要仪器  23-24
    2.1.3 总RNA的提取  24-25
    2.1.4 琼脂糖凝胶电泳  25
    2.1.5 总RNA的纯化  25
    2.1.6 琼脂糖凝胶电泳  25
    2.1.7 RNA样品纯度检测  25-26
  2.2 叶尔羌高原鳅肝胰脏cDNA文库的构建  26-32
    2.2.1 材料、试剂、仪器  26
    2.2.2 配制试剂  26-27
    2.2.3 主要仪器  27
    2.2.4 构建文库的注意事项  27
    2.2.5 具体操作  27-32
  2.3 结果与分析  32-35
  2.4 讨论  35-37
  2.5 小结  37-38
第三章 普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较  38-46
  3.1 材料、试剂、仪器  39-40
    3.1.1 材料  39
    3.1.2 实验仪器  39
    3.1.3 实验试剂  39
    3.1.4 菌株和载体  39-40
  3.2 试验方法  40-43
    3.2.1 引物设计  40
    3.2.2 普通PCR反应体系与反应程序  40
    3.2.3 降落PCR反应体系与反应程序  40-41
    3.2.4 胶回收  41
    3.2.5 叶尔羌高原鳅降落式PCR基因片段与pMD18-T载体连接  41
    3.2.6 感受态的制备  41
    3.2.7 连接产物的转化  41
    3.2.8 转化产物的培养  41-42
    3.2.9 转化菌的PCR鉴定  42
    3.2.10 质粒的提取  42-43
    3.2.11 双酶切鉴定  43
    3.2.12 送测序  43
  3.3 结果与分析  43-44
  3.4 讨论  44-45
  3.5 小结  45-46
第四章 抗菌肽Hepcidin基因的序列分析  46-52
  4.1 材料与方法  46-47
    4.1.1 材料  46
    4.1.2 方法  46-47
  4.2 结果与分析  47-50
  4.3 讨论  50-51
  4.4 小结  51-52
结论  52-53
参考文献  53-57
缩略词表  57-58
致谢  58-59
作者简介  59

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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