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杜氏盐藻生理生化鉴定及高质量cDNA文库表达序列标签分析

作　者: 张冬鑫
导　师: 红凌
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 杜氏盐藻培养条件生长曲线高质量cDNA文库表达序列标签(ESTs) 耐盐性
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种生长于海水等高盐环境中的单细胞真核绿藻,属于杜氏藻科杜氏藻属,无细胞壁结构却能在0.5～5.5 mol/L的高盐环境下生存。杜氏盐藻细胞中富含β-胡萝卜素等大量有价值的生物活性物质,另外在盐胁迫条件下能产生大量的油脂。杜氏盐藻是能进行光合自养的最耐盐的真核生物,并且细胞结构简单,因此成为研究耐盐分子机制最好的模式生物。目前,关于杜氏藻各个藻种的室内培养体系,显微形态结构及细胞生长曲线等方面的研究报道还比较少,这对盐藻的大规模生物技术开发利用和基础理论研究造成很大的障碍。本研究收集到杜氏藻的六个藻种Dunaliella salina,Dunaliella parva,Dunaliella primolecta,Dunaliella bardawil,Dunaliella tertiolecta及Dunaliella sp. ,建立和完善了该六种盐藻的培养体系。在实现室内成功养殖的基础上,利用倒置显微镜进行显微形态观察,发现六个藻种细胞都为单细胞绿藻,形状呈现圆形,椭圆形和纺锤形,细胞里面都有大型杯状叶绿体,细胞顶端都生出两条等长的鞭毛,不同藻种细胞的大小各异,其中Dunaliella salina的细胞体积最大。然后,选取其中三种杜氏藻Dunaliella parva, Dunaliella primolecta和Dunaliella Salina,分别测定其在0.75M, 1.5M, 3M和4M盐浓度条件下的生长曲线,结果表明随着盐浓度的升高,三种藻的生长状态依次变弱,三种藻都在大约10天左右进入对数生长期,50天左右进入平台期,对该三种藻在1.5M盐浓度条件下的生长曲线比较后发现parva的长势最好, primolecta次之, salina最差。现在杜氏盐藻的基因组测序计划尚未完成,在NCBI的Genbank数据库中关于盐藻的核苷酸序列及表达序列标签(ESTs, Expressed Sequence Tags)信息也十分有限。因此,为了全面开展杜氏盐藻的功能基因组学研究,更清楚地了解其耐盐的基本分子机制,需要构建一个具有代表性的高质量cDNA文库,并进行大规模的EST分析。我们在研究中采用Clontech公司的SMART?技术及其cDNA文库构建试剂盒,成功构建了1.5 mol/L NaCl盐胁迫条件下的杜氏盐藻cDNA噬粒文库。文库质量鉴定的结果均表明我们所构建的cDNA文库符合高质量全长cDNA文库标准。为了获取功能基因和耐盐机理方面的重要信息,本文鉴定了487个质量较好的ESTs,发现295个EST序列(61%)与已知杜氏盐藻ESTs或已知基因和蛋白序列有高度同源性,而高达192个ESTs(39%)未见与已知序列有任何相似性,代表盐藻细胞中大量未鉴定的新基因。大约21%的ESTs(功能注释ESTs的44%)编码与蛋白质合成和加工功能有关的蛋白(主要是蛋白质合成装置的成分核糖体蛋白),表明核糖体蛋白在盐藻细胞生命过程和耐盐调节中的重要作用。ESTs分析中除发现了大量与杜氏盐藻的蛋白质合成和加工功能有关的ESTs外,还发现了许多编码能量代谢与光合作用(功能注释ESTs的21.2%)以及初级代谢(功能注释ESTs的5.5%)功能相关的ESTs。此外,也发现了一些与细胞转运,细胞信号和细胞周期,细胞结构组分以及细胞抗逆性等功能有关的ESTs。同时将该研究中得到的ESTs与莱茵衣藻,团藻进行功能基因组学对比,发现其中245个ESTs与两者的已知功能序列具有同源性,提示其余ESTs很可能代表耐盐相关的特异性新基因。最后对这些ESTs所进行的简单全长分析还得到几个未在杜氏盐藻中报道过基因的全长编码序列。

杜氏盐藻生理生化鉴定及高质量cDNA文库表达序列标签分析

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