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BVDV RT-LAMP检测方法的建立及BRV和BVDV二联灭活疫苗的初步研制

作　者: 王腾
导　师: 孙继国
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛轮状病毒牛病毒性腹泻病毒分离鉴定逆转录环介导等温扩增技术灭活疫苗
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牛轮状病毒(Bovine Rotavirus, BRV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)的病毒，牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的病毒，二者都可以造成犊牛的腹泻。另外，BVDV还是引发繁殖障碍、粘膜病、持续性感染等疾病的病原。近年来，BRV和BVDV对于全球养牛业造成了极大的危害，严重阻碍了养牛业的发展。本研究首先从犊牛的腹泻物中分离出两株BVDV的保定地方株，分别以BD-2和BD-4为其命名。将分离株在MDBK细胞上传20代，对F1和F20代细胞毒测序鉴定，分析其基因变异程度；同时利用TCID50对F1、F10和F20代细胞毒的毒力进行测定，从而选取了更为稳定的BD-2株作为疫苗株。同时，针对BD-2编码gP48蛋白的基因序列应用Primer Explorer V4软件，对该基因序列的保守区设计了4条RT-LAMP引物，旨在建立一种针对编码gP48蛋白基因序列的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的快速检测方法。优化了反应体系、反应温度、反应时间，检测了该方法的特异性和灵敏度。结果表明，该方法在等温条件下只需要40min就能检测出结果，与普通RT-PCR方法相比更加省时，且在判定检测结果时无需昂贵的仪器设备，具有高特异性、高灵敏度、操作简便快速等特点，适合于基层临床检测的应用。实验室保存的BRV RV+株在Marc-145上传20代，亦对F1和F20代细胞毒测序鉴定，分析其基因变异程度；同时利用TCID50对其F1、F10和F20代细胞毒的毒力进行测定，发现该株BRV稳定性良好，可以作为疫苗株使用。然后，选取TCID50适宜的RV+株F1代毒和BD-2株F5代毒灭活，制成BRV和BVDV二联油乳剂灭活疫苗。对于研制出的二联灭疫活苗在昆明系小白鼠上进行安全性和免疫效力的实验室初步检测。结果显示，对小鼠的保护率达93.3%，并且安全性良好。

BVDV RT-LAMP检测方法的建立及BRV和BVDV二联灭活疫苗的初步研制

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