学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

布鲁氏菌SOD、L7/L12、OMP25、OMP31蛋白DNA疫苗的构建及对小鼠免疫原性的分析

作　者: 覃晓琳
导　师: 李继昌
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 布鲁氏菌 SOD基因 L7/L12基因 OMP25基因 OMP31基因 DNA疫苗
分类号: S855.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 45次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患病。布鲁氏菌的宿主范围主要包括家畜、家禽、野生动物以及人，能够引起发热、流产与不育、慢性关节炎和神经损害等症状。世界上多个国家和地区有布鲁氏菌病的存在，造成了巨大的经济损失。因此，布鲁氏菌病的预防工作是非常重要的，采用疫苗接种的方式是防治布鲁氏菌病的重要方法。本研究中，以B. melitensis强毒株M28为模板，PCR分别扩增SOD、L7/L12、OMP25、OMP31基因，产物经回收纯化、EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，克隆至pCAGG质粒中，构建真核表达质粒pCAGG-SOD、pCAGG-L7/L12、pCAGG-OMP25、pCAGG-OMP31。然后，将B.melitensis强毒株M28的SOD和OMP25基因经PCR扩增，克隆至pET-32a质粒的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，构建重组表达质粒pET-SOD和pET-OMP25。pET-SOD和pET-OMP25质粒分别在BL21（DE3）感受态细胞中经IPTG诱导表达，镍琼脂糖凝胶亲和层析分离重组SOD蛋白（rSOD）和重组OMP25蛋白（rOMP25）。小鼠免疫实验中，用上述四种质粒pCAGG-SOD、pCAGG-L7/L12、pCAGG-OMP25、pCAGG-OMP31（DNA组）联合免疫BALB/c小鼠，同时设置弱毒疫苗M5-90组、PBS组、pCAGG组作为三组对照。通过利用间接ELISA实验的方法，对免疫小鼠血清中特异性抗体水平进行检测；进而，通过利用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和流式细胞术（FCM）的实验方法，对免疫小鼠的细胞免疫水平进行检测。本研究结果显示，rSOD和rOMP25蛋白分子量分别为34ku和43ku；间接ELISA结果表明DNA组特异性IgG抗体水平显著高于M5-90组（p<0.05）；ELISPOT结果表明DNA组分泌IFN-γ的细胞数目显著高于M5-90组；FCM结果表明DNA疫苗和M5-90免疫小鼠能够引起小鼠CD4+T和CD8+T细胞含量升高，DNA组小鼠CD4+T和CD8+T细胞含量升高更明显。综上，编码布鲁氏菌SOD、L7/L12、OMP25、OMP31基因的DNA疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫反应和细胞免疫反应，此DNA疫苗有望作为预防布鲁氏菌病的候选疫苗。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-21
  1.1 布鲁氏菌简介  11
  1.2 布鲁氏菌病流行病学  11-12
  1.3 布鲁氏菌病原学  12
  1.4 布鲁氏菌病临床症状  12-13
  1.5 布鲁氏菌病诊断方法  13-15
    1.5.1 细菌学鉴定  13
    1.5.2 核酸鉴定  13
    1.5.3 凝集试验  13-14
    1.5.4 ELISA  14
    1.5.5 FPA  14-15
    1.5.6 免疫胶体金技术  15
  1.6 布鲁氏菌病疫苗研究  15-18
    1.6.1 Rev.1  15-16
    1.6.2 S2  16
    1.6.3 M5  16
    1.6.4 S19  16
    1.6.5 灭活疫苗  16-17
    1.6.6 突变株疫苗  17
    1.6.7 DNA 疫苗  17-18
  1.7 布鲁氏菌抗原和毒力相关基因  18-20
    1.7.1 L7/L12 蛋白  18
    1.7.2 外膜蛋白  18-19
    1.7.3 毒力基因  19-20
  1.8 研究的目的和意义  20-21
2 材料与方法  21-31
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 菌株、质粒、重组蛋白  21
    2.1.2 实验动物  21
    2.1.3 主要试剂及仪器  21
    2.1.4 主要试剂的配制  21-22
  2.2 试验方法  22-31
    2.2.1 真核表达质粒的构建  22-26
    2.2.2 蛋白表达及纯化  26-29
    2.2.3 小鼠接种试验  29
    2.2.4 间接 ELISA 检测血清抗体水平  29
    2.2.5 小鼠脾脏淋巴细胞的制备  29-30
    2.2.6 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）  30
    2.2.7 流式细胞计数器检测  30-31
3 结果与分析  31-41
  3.1 真核表达质粒构建结果  31-34
    3.1.1 SOD 基因的扩增及 pCAGG-SOD 酶切鉴定  31
    3.1.2 L7/L12 基因的扩增及 pCAGG-L7/L12 酶切鉴定  31-32
    3.1.3 OMP25 基因的扩增及 pCAGG-OMP25 酶切鉴定  32
    3.1.4 OMP31 基因的扩增及 pCAGG-OMP31 酶切鉴定  32-34
  3.2 蛋白表达及纯化  34-37
    3.2.1 目的基因的扩增与重组质粒的鉴定  34-35
    3.2.2 重组蛋白的表达及纯化  35-37
  3.3 间接 ELISA 检测血清抗体水平  37
  3.4 酶联免疫斑点实验  37-38
  3.5 流式细胞计数器检测结果  38-41
    3.5.1 CD8+T 结果  38-39
    3.5.2 CD4+T 结果  39-41
4 讨论  41-44
  4.1 DNA 疫苗的构建  41
  4.2 表达载体的选择  41-42
  4.3 间接 ELISA 结果分析  42
  4.4 ELISPOT 结果分析  42-43
  4.5 FCM 结果分析  43-44
5 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-51
攻读学位期间发表的学术论文  51

相似论文

  1. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  2. 家畜布鲁氏菌病流行病学调查及布鲁氏菌单核苷酸多态性分子分型研究,S855.12
  3. 乙型脑炎病毒NS1蛋白的新型prime-boost免疫策略研究,R392
  4. 霍乱毒素A、B亚单位对HIV-1调节/辅助基因DNA疫苗的佐剂效应研究,R392
  5. 抗菌肽Shiva-1a基因在杆状病毒中表达及山羊转基因核供体细胞的制备,S827
  6. 生鲜牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测与汉中市四种动物疫病免疫抗体的检测,R155.5
  7. 日本血吸虫DNA疫苗在小鼠体内的代谢及时空表规律研究,S855.91
  8. pcDNA3.1（+）/ICP27重组HSV-2DNA疫苗的构建及在真核细胞中的表达,R392
  9. 用于防龋DNA疫苗粘膜传递的有效载体的研究,R392.1
  10. 表达融合蛋白CFP21-MPT64和ESAT-6-CFP10的DNA疫苗增强BCG初免小鼠抗结核病的保护性,R392
  11. App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究,S858.28
  12. 猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗的构建及间接ELISA方法的建立,S858.28
  13. 牛结核病三价DNA疫苗制备工艺研究及免疫效果初步评价,S858.23
  14. 布鲁氏菌omp31、omp2b基因重组山羊痘病毒的构建及免疫原性初步研究,S858.23
  15. 羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析,S858.26
  16. 鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验,S858.31
  17. 卡氏肺孢子菌p55基因片段DNA疫苗免疫保护作用的研究,R392.1
  18. 哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompU的克隆表达、DNA疫苗构建及对大菱鲆免疫效果探究,S941
  19. 减毒沙门氏菌介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因疫苗的构建及其小鼠免疫试验研究,S858.28
  20. 新型免疫刺激分子增强DNA疫苗免疫原性的研究,S852.52
  21. 牙龈卟啉单胞菌Kgp DNA疫苗治疗种植周围炎的实验研究,R783.6

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病
© 2012 www.xueweilunwen.com