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奶牛X、Y精子性别差异表达基因筛选

作　者: 孙献莹
导　师: 高庆华
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 奶牛 X精子 Y精子差异表达基因荧光原位杂交
分类号: S823.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本论文旨在研究奶牛X、Y精子间特异性基因差异表达情况,采用本实验自行优化设计的固相消减杂交策略构建奶牛Y精子对X精子消减杂交cDNA质粒库,结合生物信息学分析对筛选出的差异基因进行分析,并通过FISH对筛选出的基因的特异性进行验证。研究结果如下1.在固相磁珠上进行荷斯坦奶牛x精子和Y精子mRNA提取、X精子cDNA合成及Y精子对X精子的消减杂交,获得的差异片段经SMART扩增后构建Y精子对X精子消减杂交cDNA质粒库,克隆鉴定后测序,在线进行序列同源性分析。比对结果显示筛选出的基因与牛EST数据库中的序列高度同源,其中之一确认为牛Sry基因,其余为牛未知功能基因。2.根据消减杂交cDNA质粒库筛选出的牛已知Sry基因序列设计特异性引物,以奶牛常规细管冻精cDNA为模版进行PCR扩增,制备地高辛标记探针。对奶牛分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子FISH。根据荧光信号的有无可准确分辨X精子和Y精子并将奶牛Sry mRNA定位在Y精子尾部中段。FISH测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%,与对应精子纯度比较差异不显著(P>0.05)。为鉴定其他精子特异性表达基因方法提供可靠的技术支持。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章文献综述  8-17
  1.1 精子与性别控制  8-9
  1.2 性控蛋白疫苗候选分子研究  9-13
    1.2.1 精子膜抗原  9-12
    1.2.2 受精抗原  12
    1.2.3 LDH-C4  12-13
  1.3 性控蛋白疫苗问题及展望  13
  1.4 性控DNA疫苗研究进展  13-14
  1.5 性控DNA疫苗展望  14-15
  1.6 研究目的  15-17
第二章 Y精子对X精子消减杂交  17-27
  2.1 样品  17
  2.2 主要试剂  17-18
  2.3 仪器设备  18
  2.4 实验方法  18-23
    2.4.1 奶牛X、Y精子mRNA提取  18
    2.4.2 mRNA纯化  18-19
    2.4.3 Y精子对X精子消减杂交  19
    2.4.4 消减杂交产物SMART  19-21
    2.4.5 消减杂交产物的克隆测序  21-22
    2.4.6 阳性克隆检测和测序  22-23
  2.5 实验结果  23-24
    2.5.1 菌液PCR检测结果  23
    2.5.2 Y-X精子消减杂交cDNA质粒库测序及分析结果  23-24
  2.6 讨论  24-26
    2.6.1 关于精子纯度的讨论分析  24
    2.6.2 关于精子RNA的讨论分析  24-25
    2.6.3 生物信息学分析  25-26
  2.7 小结  26-27
第三章 Sry探针精子FISH  27-38
  3.1 样品  27
  3.2 主要试剂  27-28
  3.3 主要仪器设备  28
  3.4 主要溶液配制  28-29
  3.5 实验方法  29-34
    3.5.1 探针制备  29-32
    3.5.2 玻片处理  32
    3.5.3 精子标本制备  32-33
    3.5.4 精子FISH  33
    3.5.5 数据收集与分析  33-34
  3.6 结果  34-36
  3.7 讨论  36-37
  3.8 小结  37-38
结论  38-39
参考文献  39-44
致谢  44-45
作者简介  45

奶牛X、Y精子性别差异表达基因筛选

内容摘要

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