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精子差异表达基因原位杂交方法的建立

作　者: 沈波
导　师: 高庆华
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 精子原位杂交差异表达基因
分类号: S814.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

通过Y精子对X精子扣除杂交获得数段mRNA序列,通过Y精子对X精子扣除杂交获得的序列仅仅只能从理论上推断其属于Y精子差异表达基因序列,尚需进一步通过实验方法确定其属于Y精子差异表达基因序列。本实验旨在建立差异表达基因的精子原位杂交方法。目前尚未见精子RNA原位杂交方法的报道。本实验用Dnae A去除DNA,再进行固定,这样确保了精子RNA与探针杂交。传统的去除精子鱼精蛋白方法造成了精子形态的极大破坏。本实验采用了蛋白酶K去除鱼精蛋白,建立了一种新的差异表达基因序列精子DNA原位杂交方法。对染色体培养低渗时间进行了对比,优化了染色体定位技术。实验选取262bp基因序列在Y精子RNA上是差异表达的。实验选取262bp基因序列在Y精子RNA上差异表达也证明Y-X精子扣除杂交是成功的。实验选取的323bp基因序列位于常染色体上。在37℃下,用浓度为30μg/mL的蛋白酶K处理精子20min能最有效的去除蛋白质。实验选取262bp基因序列位于5号染色体上。解冻的培养基在38.5℃预热2h以上,低渗时间在40min左右能更利于染色体的培养。本实验建立了精子RNA差异表达基因原位杂交方法。建立了一种新的精子DNA原位杂交方法。优化了染色体定位技术。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-17
  1 精子细胞核染色质研究现状  9-12
  2 精子形态结构研究现状  12-13
  3 精子RNA研究现状  13-15
  4 原位杂交的研究现状  15-17
第二章精子RNA差异性表达基因原位杂交  17-22
  1 材料与方法  17-19
    1.1 实验材料  17-18
      1.1.1 样品  17
      1.1.2 序列  17
      1.1.3 主要试剂  17-18
      1.1.4 主要仪器  18
    1.2 方法  18-19
      1.2.1 精子标本制备  18
      1.2.2 精子RNA提取及cDNA转化  18-19
      1.2.3 探针制备  19
      1.2.4 精子FISH  19
  2 结果与分析  19-20
  3 讨论  20-21
  4 结论  21-22
第三章精子DNA原位杂交方法的优化及建立  22-35
  实验一精子原位杂交蛋白酶K浓度的优化  22-27
    1 材料与方法  22-23
      1.1 材料  22
        1.1.1 主要试剂  22
        1.1.2 主要仪器  22
      1.2 方法  22-23
    2 结果与分析  23-24
    3 讨论  24-26
      3.1 精子原位杂交蛋白酶K浓度优化的理论基础  24-25
      3.2 精子原位杂交蛋白酶K浓度优化的判定标准  25-26
    4 结论  26-27
  实验二精子差异表达基因序列DNA原位杂交  27-35
    1 材料与方法  27-30
      1.1 实验材料  27-28
        1.1.1 样品  27
        1.1.2 序列  27
        1.1.3 主要试剂  27
        1.1.4 主要仪器  27-28
        1.1.5 主要溶液  28
      1.2 方法  28-30
        1.2.1 精子标本的制备  28
        1.2.2 牛血DNA的提取  28-29
        1.2.3 引物设计及扩增  29
        1.2.4 DNA回收  29-30
        1.2.5 探针制备  30
        1.2.6 杂交  30
    2.结果与分析  30-32
    3. 讨论  32-34
    4 结论  34-35
第四章特异表达基因染色体定位  35-43
  实验一奶牛染色体培养条件优化  35-39
    1 材料与方法  35-36
      1.1 实验材料  35
        1.1.1 主要试剂  35
        1.1.2 主要仪器  35
      1.2 方法  35-36
        1.2.1 玻片的制作  35
        1.2.2 综合培养基的配制  35
        1.2.3 染色体的制备  35-36
    2 结果与分析  36-37
    3 讨论  37-38
      3.1 染色体培养的无菌观念  37
      3.2 培养基温度对结果的影响及改进  37-38
      3.3 染色体培养低渗时间的优化  38
    4 结论  38-39
  实验二差异表达基因染色体定位  39-43
    1 材料与方法  39-40
      1.1 实验材料  39-40
        1.1.1 序列  39
        1.1.2 主要仪器  39
        1.1.4 主要试剂  39
        1.1.5 主要溶液  39-40
      1.2 方法  40
        1.2.1 玻片的制作  40
        1.2.2 牛血DNA的提取  40
        1.2.3 引物设计及扩增  40
        1.2.4 DNA回收  40
        1.2.5 探针制备  40
        1.2.6 杂交  40
    2 结果与分析  40-41
    3 讨论  41
    4 结论  41-43
第五章全文结论  43-44
  1 论文总体结论  43
  2 本研究的创新点  43-44
参考文献  44-47
致谢  47-48
个人简历  48

精子差异表达基因原位杂交方法的建立

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