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板栗短雄花序芽变与赤霉素相关的分子机理研究

作　者: 郭献平
导　师: 秦岭
学　校: 新疆农业大学
专　业: 果树学
关键词: 板栗芽变雄花序贝壳杉烯氧化酶贝壳杉烯酸氧化酶瞬时超表达荧光定量 Southern杂交
分类号: S664.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

板栗(Castanea mollissima Bl.)生产中一直存在着低产问题,主要是由于雄花多、雌花少造成的。因此,选育雌花多,雄花数量少、雄花序退化或者早期脱落的丰产优质品种,是解决板栗低产的有效途径。项目组在北京市密云县板栗产区发现一株自然实生变异的板栗芽变母株,在同一株树上,一枝上的雄花序短小,而其余枝上的雄花序正常。芽变雄花序在生长发育过程中,中上部发生细胞程序性死亡(PCD),花序变黄,弯曲,最后枯死脱落,而基部的花序发育正常,雄花序的平均长度2.2cm,只有普通板栗雄花序长度的1/6-1/8。此新品种通过国家林业局审定命名为‘短花云丰’(新品种保护权：20090015)。前期研究还发现,该雄花序的短化与赤霉素密切相关,在芽变雄花序发育的整个过程贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)表达量显著低于野生型,且活性赤霉素含量也低于野生型。本文比对了板栗野生和芽变雄花序(?)’PS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1基因的cDNA序列；通过构建KAO和KO基因的瞬时超表达载体,对芽变雄花序进行了侵染,以期获得芽变短雄花序赤霉素含量降低的分子机制,为芽变短雄花序的赤霉素缺陷型鉴定提供支持,同时为板栗产量的调控机制提供理论基础。主要结果如下：1.通过对赤霉素合成关键酶基因CPS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1在板栗花簇原基形成期的荧光定量分析发现,KAO基因在芽变雄花序中表达量极显著低于野生型,表达量只有野生型的一半。而其他五种基因在野生和芽变的花簇原基形成期相对表达量无显著差异。以板栗雄花序为模板,获得板栗KAO基因DNA全长共6086bp,有8个外显子,7个内含子。Tail-PCR扩增KAO基因启动子区域,通过比对的启动子序列,发现翻译起始位点上游-251处野生雄花序的T碱基突变为芽变型的A。2.将板栗KAO基因全长核苷酸序列插入到pCAMBIA1304质粒的BglⅡ和PmlⅠ酶切位点之间,构建成植物超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO。在芽变短雄花序的雄花序原基形成期,以农杆菌介导将携带有KAO基因载体菌液,用1mL的注射器,在雄花序上进行注射,并进行涂抹,建立了板栗花序的瞬时表达体系。3.在表型上,侵染后20天芽变雄花序对照(MT)和空载体侵染对照(MT+EV)发生细胞程序性死亡,被侵染的雄花序(MT+KAO)未发生细胞程序性死亡,且MT+KAO长度是MT和MT+EV的2-3倍：取样后在MT+EV和MT+KAO中检测到CaMV35S,说明二者被农杆菌侵染。经荧光定量分析,KAO基因在MT+KAO表达量极显著高于MT和MT+EV。半定量分析结果也显示MT+KAO表达量明显高于MT和MT+EV。4.通过比对板栗野生和芽变雄花序CPS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1基因的cDNA和DNA序列,只发现两类花序的KO一个等位基因KO2中A-872,A-1115,T-1150碱基突变为芽变雄花序K03的G-872,T-1115,C-1150,分别造成了氨基酸由Glu-291、Tyr-372、Tyr-384突变为Gly-291、Phe-372、His-384,而KO另一等位基因KO1未发生碱基突变。经生物信息学分析,KO2和KO3的蛋白质分子量分别为58.765和58.651kDa,理论等电点分别为8.63和8.75,二者在二级结构中存在6处差异,且K03比K02多了一个跨膜区域。Southern杂交结果显示,KO在野生雄花序中有一个拷贝,而在芽变雄花序中有两个拷贝。5.构建了K01基因植物超表达载体pCAMBIA1304-CmKO1。在芽变短雄花序的雄花序原基形成期,对芽变短雄花序进行瞬时超表达,侵染后30天芽变雄花序对照(MT1)、空载体侵染对照(MT+EV1)和被侵染的雄花序(MT+KO1)均发生细胞程序性死亡,但经KO1基因超表达的雄花序花簇较多。取样后在MT+EV1和MT+KO1中检测到CaMV35S,说明二者被农杆菌侵染。经荧光定量分析,KO1基因在MT+KO1表达量极显著高于MT1和MT+EV1。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章绪论  12-23
  1.1 板栗分布及生长条件  12
  1.2 板栗花芽分化及板栗芽变品种  12-15
  1.3 赤霉素基本合成途径及赤霉素缺陷型突变体  15-19
  1.4 本文的研究背景及目的意义  19-23
第2章板栗内根-贝壳杉烯酸氧化酶基因(CmKAO)瞬时超表达延迟芽变雄花序细胞程序性死亡  23-42
  2.1 材料与方法  24-34
    2.1.1 试验材料  24
    2.1.2 花序总RNA的提取及纯化  24-25
    2.1.3 cDNA第一链的合成  25-26
    2.1.4 基因序列及引物的获取  26
    2.1.5 RT-qPCR  26
    2.1.6 板栗KAO基因DNA全长  26-28
    2.1.7 板栗野生和芽变雄花序KAO基因启动子比对  28-30
    2.1.8 CmKAO基因植物表达载体质粒pCAMBIA1304-CmKAO的构建  30-32
    2.1.9 农杆菌转化pCAMBIA1304-CmKAO质粒  32-33
    2.1.10 植物表达载体pCAMBIA1304-CmKAO遗传转化  33
    2.1.11 荧光定量分析  33
    2.1.12 半定量分析  33
    2.1.13 数据处理  33-34
  2.2 结果与分析  34-38
    2.2.1 赤霉素合成关键酶基因在板栗野生和芽变雄花序花簇原基形成期的相对表达量  34
    2.2.2 KAO基因DNA序列及野生和芽变雄花序KAD cDNA、启动子序列比较分析  34-35
    2.2.3 植物表达载体pCAMBIA1304-CmKAO检测  35-36
    2.2.4 芽变短雄花序在CmKAO瞬时超表达后表型  36-38
    2.2.5 CmKAO在芽变雄花序中瞬时超表达后荧光定量和半定量分析  38
  2.3 小结与讨论  38-42
第3章板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因比较分析  42-54
  3.1 材料与方法  42-47
    3.1.1 试验材料  42
    3.1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成  42-43
    3.1.3 DNA提取  43
    3.1.4 CPS、KS、KO、KAO、GA20ox1、GA3ox1 cDNA与KO突变区DNA PCR扩增  43-44
    3.1.5 Southern杂交  44-45
    3.1.6 CmKO1植物表达载体质粒pCAMBIA1304-CmKO1构建及遗传转化  45-47
    3.1.7 数据分析  47
  3.2 结果与分析  47-52
    3.2.1 野生和芽变雄花序在KO基因DNA水平上碱基差异造成cDNA碱基差别  47-48
    3.2.2 KO基因在野生与芽变雄花序中拷贝数  48-49
    3.2.3 芽变雄花序中KO蛋白与野生型之间的比较  49-51
    3.2.4 芽变短雄花序在CmKO1瞬时超表达后表型及荧光定量分析  51-52
  3.3 小结讨论  52-54
第4章结论  54-56
附录  56-61
参考文献  61-69
致谢  69-70
作者简历  70

板栗短雄花序芽变与赤霉素相关的分子机理研究

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