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山核桃CcLFY基因启动子的克隆及功能分析

作　者: 李峥
导　师: 王正加
学　校: 浙江农林大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 山核桃 CcLFY启动子序列分析表达分析荧光定量分析
分类号: S664.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为了解山核桃LEAFY同源基因CcLFY的表达调控规律，从分子角度解释山核桃成花特点，我们应用染色体步移法克隆到一条1345bp的片段，经过软件分析该序列含有低温响应元件、光响应元件、ABA响应元件和一些其他的调控序列，推测CcLFY的表达受低温、光照等调控，但没有发现典型的TATA-box和CAAT-box结构，仅在起始密码子上游-86bp和-252bp处发现类似TATA-box和CAAT-box的结构。经过缺失验证，发现缺失掉这段结构后的启动子片段仍然具有启动能力，因此我们推断CcLFY启动子为TATA-less启动子。将山核桃CcLFY启动子与拟南芥和杨树LFY基因启动子进行比较，所含的顺式作用元件类型基本相同。通过对不同长度的启动子缺失片段进行烟草瞬时表达检测，发现-1302bp至-958bp和-592bp至-315bp处序列被缺失，GUS表达量增加，说明这两处存在着反式作用因子结合部位，将其缺失掉后，这种抑制被打破。此外，TATA-box的替代机制可能存在于5’非翻译区上游151bp范围内。通过荧光定量分析，全长启动子诱导GUS的表达量在低温条件下从8.93到18.24nmol MU/min.mg；光照条件下GUS的表达量从8.93到18.24nmolMU/min.mg，说明在自然环境中低温和光照可以诱导山核桃开花。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-10
第一章文献综述  10-18
  1.1 植物开花综述  10-11
    1.1.1 春化途径  10
    1.1.2 自主途径  10-11
    1.1.3 光周期途径  11
    1.1.4 GA途径  11
  1.2 成花促进基因LEAFY  11-12
  1.3 启动子的研究概述  12-13
    1.3.1 植物启动子的基本结构及其功能  12-13
  1.4 启动子的类型  13-14
    1.4.1 组成型启动子  14
    1.4.2 组织特异型启动子  14
    1.4.3 诱导型启动子  14
    1.4.4 双向启动子和人工启动子  14
  1.5 研究启动子功能的技术方法  14-16
    1.5.1 启动子的克隆方法  15
      1.5.1.1 利用PCR的方法克隆启动子  15
      1.5.1.2 启动子探针型质粒载体  15
    1.5.2 启动子的预测工具  15-16
    1.5.3 启动子强弱和功能的定性、定量检测  16
  1.6 本研究的目的及意义  16-18
第二章启动子克隆与序列分析  18-32
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 植物材料  18
    2.1.2 菌株和质粒：  18
    2.1.3 酶与各种生化试剂：  18
    2.1.4 PCR引物  18-19
  2.2 实验方法  19-24
    2.2.1 植物组织总DNA的提取及其检测  19-20
    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA  20
    2.2.3 CcLFY启动子克隆的第一次步移  20-24
      2.2.3.1 引物设计  20-21
      2.2.3.2 特异性单引物线性扩增  21
      2.2.3.3 单引物PCR产物的回收  21
      2.2.3.4 单引物PCR产物的加尾  21-22
      2.2.3.5 加尾产物的PCR扩增  22
      2.2.3.6 巢式扩增  22-23
      2.2.3.7 DNA的回收、连接、转化与测序  23
      2.2.3.8 序列分析  23
      2.2.3.9 第二次步移  23
      2.2.3.10 第三次步移  23
      2.2.3.11 全长启动子的扩增  23-24
    2.2.4 CcLFY启动子的序列分析  24
  2.3 结果与分析  24-30
    2.3.1 第一次步移结果  24-25
    2.3.2 第二次步移结果  25-26
    2.3.3 第三次步移结果  26
    2.3.4 全长启动子的扩增结果  26
    2.3.5 启动子序列分析  26-28
    2.3.6 顺式作用元件的分析  28-30
  2.4 结论与讨论  30-32
第三章山核桃CCLFY基因启动子表达载体的构建  32-39
  3.1 实验材料  32
    3.1.1 菌株和质粒  32
    3.1.2 酶与各种生化试剂：  32
  3.2 实验方法  32-38
    3.2.1 中间载体的构建  32
    3.2.2 表达载体的构建  32-33
    3.2.3 表达载体的鉴定  33
    3.2.4 启动子缺失表达载体构建  33-34
    3.2.5 制备大肠杆菌感受态细胞  34-35
    3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化  35
    3.2.7 应用试剂盒提取质粒  35-38
  3.3 结果与分析  38
    3.3.1 表达载体的鉴定  38
      3.3.1.1 质粒PCR鉴定  38
      3.3.1.2 酶切鉴定  38
      3.3.1.3 测序鉴定结果  38
  3.4 结论与讨论  38-39
第四章山核桃CCLFY基因启动子的表达分析  39-48
  4.1 实验材料  39
    4.1.1 菌株和质粒：  39
    4.1.2 酶与各种生化试剂：  39
  4.2 实验方法  39-43
    4.2.1 重组农杆菌工程菌株获得  39-40
      4.2.1.1 农杆菌感受态细胞的制备  39-40
      4.2.1.2 重组质粒转化农杆菌感受态细胞及筛选鉴定  40
    4.2.2 无菌烟草叶片的准备  40
    4.2.3 农杆菌叶盘侵染  40-41
      4.2.3.1 农杆菌培养  40
      4.2.3.2 侵染  40
      4.2.3.3 共培养  40-41
      4.2.3.4 组织化学染色法检测 GUS 活性  41
    4.2.4 对共培养后的烟草叶盘不同环境条件处理  41
    4.2.5 GUS 活性的荧光定量测定  41-43
      4.2.5.1 溶液配制  41-42
      4.2.5.2 葡聚糖苷酶活性测定  42-43
  4.3 结果与分析  43-47
    4.3.1 CcLFY 基因启动子表达载体转入农杆菌  43-44
    4.3.2 CcLFY 基因启动子瞬时表达  44-45
    4.3.3 不同环境条件处理后的 GUS 荧光定量检测  45-47
  4.4 结论与讨论  47-48
第五章结论  48-49
  5.1 主要研究成果  48
  5.2 研究展望  48-49
参考文献  49-60
个人简介  60
攻读硕士学位期间完成的论文  60
攻读硕士学位期间参加的会议  60-61
致谢  61

山核桃CcLFY基因启动子的克隆及功能分析

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