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桑树枝条韧皮部桑根皮素的制备及其对小鼠H_(22)细胞株移植性肿瘤的抑制作用

作　者: 马斌
导　师: 张雨青
学　校: 苏州大学
专　业: 生物物理学
关键词: 桑根皮素 醇提物 高效液相色谱 桑枝皮 基因表达 荧光定量分析 Caspase-3 NF-κB H22移植瘤模型
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本实验主要以桑树栽培种湖桑32号的桑树枝条韧皮部（简称桑枝皮）为试验材料，采用无水乙醇提取、大孔树脂的吸附与分离、葡聚糖凝胶柱洗脱和半制备反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化等方法，经过高效液相色谱二级管陈列检测（HPLC-DAD）和与标准品紫外光谱比对分析与鉴定，分离到的高纯单体为桑根皮素（morusin）。以桑根皮素标准品绘制的线性方程定量分析待测样品中桑根皮素的含量，桑根皮素在0.05-1.00μg范围内与其吸光度值具有很好的线性关系，相关系数为R2=0.9996。同时，应用HPLC-DAD色谱法测定桑枝皮中桑根皮素的重现性和回收率分别为6.02%和100.62%。桑树不同部位中桑根皮素的含量分析结果显示，湖桑32的桑枝皮中桑根皮素含量与根皮中含量相差甚微，而在桑叶中没有发现桑根皮素的存在；桑品种为延边秋雨的桑枝皮中桑根皮素含量约是其根皮中的3倍。100个桑树栽培品种的桑枝皮中桑根皮素含量差异显著，高低可达20倍之多。湖桑32枝条皮中桑根皮素含量为200.22μg/g，湖桑13号品种的桑枝皮中含量最高为585.81μg/g，而引三桑品种的枝条皮中其含量最低仅为29.64μg/g。本试验结果表明，本文应用的RP-HPLC-DAD分析法对鉴定和分析桑树或桑枝皮中桑根皮素的方法快速、可靠。我们可以从大量废弃的桑树枝条皮中大量提取和回收具有抗肿瘤、抗菌、抗艾滋病毒等活性成份—桑根皮素，为农业废弃物桑树枝条的高效利用和高附加值的开发打下良好的基础。为了研究桑根皮素抗肿瘤等方面的作用机制，本实验利用分子生物学的方法，定量检测某些相关抗肿瘤基因的表达情况。通过小鼠肝癌肿瘤细胞株的移植，建立了移植瘤H22肝癌肿瘤小鼠的模型，采用腹腔注射的治疗方式，研究了桑根皮素抑制腋下H22实体瘤荷瘤模型小鼠肿瘤的发育情况和病理组织学的变化。随机将H22移植瘤肝癌小鼠分为5组：注射生理盐水的模型组，注射桑根皮素低（10mg/kg·d）、中（20mg/kg·d）、高（40mg/kg·d）剂量的样品处理组，以及注射抗肿瘤药物的5-氟尿嘧啶为阳性对照组，给药10d，剖去瘤块、脾脏和肝脏，计算抑瘤率及肝脏、脾脏系数增长率和体质量增长率；采用HE染色对肿瘤和肝脏进行病理观察；以肿瘤模型组为对照，桑根皮素低、中、高剂量注射组及5-氟尿嘧啶阳性对照组对肿瘤的生长均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分别为13.84%、26.21%、34.43%和47.21%；肝脏和脾脏系数增长率及体质量增长率结果显示，桑根皮素对小鼠肝脏、肾脏和体质量增长无明显影响。以5-氟尿嘧啶注射组为实验对照的荧光定量PCR（QPCR）定量分析研究表明，经桑根皮素处理的H22小鼠与模型组相比，桑根皮素各剂量注射组的P53、Caspase-3、Survivin和CyclinB1基因表达显著上升，具有统计学意义（P＜0.05）。桑根皮素低、中、高剂量治疗组中Caspase-3的基因表达水平均明显高于模型组（P＜0.01）；其低剂量组Caspase-3基因表达水平大大高于模型组达4倍以上，中、高剂量实验组Caspase-3基因表达水平虽低于低剂量组，但也分别高于模型组3.6和3.0倍。随着注射桑根皮素浓度的上升，样品处理组的抑制效果呈现下降趋势，即呈剂量-效应的逆向关系。荷瘤模型组中NF-κB基因表达水平最高，高剂量样品注射组NF-κB基因表达量最低，与模型组表达量相比下调到36.5%。这三个剂量的桑根皮素样品注射组对NF-κB基因表达的下调作用都达到非常显著的水平（p＜0.01）。根据以上荧光定量分析的实验结果，我们可以推测桑根皮素的抗肝癌作用的机制是通过上调Caspase-3基因表达水平并下调NF-κB基因表达水平来促进肿瘤细胞的凋亡，最终使瘤体变性坏死达到抗癌的效果。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-12
前言  12-13
第一章 文献综述  13-33
  1. 概述  13-14
  2. 桑树抗肿瘤活性成份的研究概况  14-16
  3 桑根皮素的研究现状  16-19
    3.1 桑根皮素的结构及鉴定  16
    3.2 桑根皮素的检测和提取方法  16-17
    3.3 桑根皮素的药理作用  17-19
      3.3.1 镇痛、抗炎和免疫调控作用  17-18
      3.3.2 抗艾滋病病毒(HIV)作用  18
      3.3.3 抗菌作用  18
      3.3.4 抗肿瘤作用  18-19
      3.3.5 其他药理作用  19
  4 肿瘤相关基因的研究  19-22
    4.1 P53 与肿瘤的关系  19-20
    4.2 Survivin 与肿瘤的关系  20
    4.3 CyclinB1 与肿瘤的关系  20-21
    4.4 Caspase-3 与肿瘤的关系  21
    4.5 NF-κB 与肿瘤的关系  21-22
  5 本论文的研究内容与意义  22-24
    5.1 主要研究内容  22-23
    5.2 研究意义  23-24
  参考文献  24-33
第二章 实验材料与方法  33-42
  1 实验试剂、材料及仪器  33-34
    1.1 实验材料  33
    1.2 仪器与设备  33
    1.3 试剂与材料  33-34
  2 实验设计与方法  34-41
    2.1 桑枝皮醇提物的制备  34
    2.2 高效液相色谱法（HPLC）分析  34-35
      2.2.1 样品的配制  34
      2.2.2 色谱条件  34
      2.2.3 桑根皮素的紫外可见光谱测定  34-35
    2.3 桑根皮素含量测定  35
      2.3.1 桑根皮素标准曲线的绘制  35
      2.3.2 桑枝皮中桑根皮素乙醇提取的稳定性实验  35
      2.3.3 桑枝皮中桑根皮素的 HPLC 法测定回收率试验  35
      2.3.4 桑根皮素 HPLC 梯度洗脱分析法的重现性试验  35
    2.4 桑根皮素单体的提取、分离与纯化  35-37
      2.4.1 D101 大孔树脂的预处理  35-36
      2.4.2 D101 大孔树脂吸附与分离  36
      2.4.3 葡聚糖凝胶的预处理及再生  36
      2.4.4 E100 在 Sephadex LH20 柱上的分离与收集  36
      2.4.5 D101-Sephadex LH20 组分的半制备反相 HPLC 收集  36-37
    2.5 动物实验  37-41
      2.5.1 实验动物  37
      2.5.2 移植瘤 H22肝癌肿瘤小鼠模型的建立  37
      2.5.3 实验分组  37-38
      2.5.4 病理组织切片与观察  38
      2.5.5 RNA 提取  38-39
      2.5.6 引物设计  39
      2.5.7 RNA 反转录成 cDNA  39-40
      2.5.8 荧光定量 PCR 的操作步骤  40-41
  参考文献  41-42
第三章 实验结果分析与讨论  42-70
  1. 结果与分析  42-47
    1.1 桑根皮素的鉴定  42-43
    1.2 桑根皮素分离与纯化  43-47
      1.2.1 桑枝皮醇提物的大孔树脂吸附与分离  43-44
      1.2.2 D101-E100 组分反相 HPLC 结果  44-45
      1.2.3 D101-E100 组分在 Sephadex-LH20 上的纯化与分离  45-46
      1.2.4 纯化样品桑根皮素在反相 HPLC 色谱柱上的分析  46-47
  2 桑树中桑根皮素的水平与分布  47-52
    2.1 桑根皮素标准曲线  47
    2.2 HPLC 法测定桑枝皮中桑根皮素的回收率  47-48
    2.3 桑根皮素 HPLC 分析法的重现性  48
    2.4 无水乙醇提取桑枝皮中桑根皮素的稳定性  48
    2.5 桑树不同部位中桑根皮素的水平  48-50
    2.6 桑枝皮中桑根皮素的品种差异  50-52
  3 桑根皮素对肿瘤小鼠的影响  52-66
    3.1 桑根皮素对肿瘤小鼠体重和肿瘤的影响  52-55
      3.1.1 模型小鼠生活状态及体重的变化  52-54
      3.1.2 桑根皮素对 H22 肝癌肿瘤小鼠的肿瘤生长的影响  54
      3.1.3 桑根皮素对肿瘤小鼠肝脏和脾脏发育的影响  54-55
    3.2 病理组织学变化  55-59
      3.2.1 桑根皮素对小鼠 H22肝癌细胞移植瘤的细胞形态和数量的影响  55-57
      3.2.2 桑根皮素对移植瘤 H22小鼠肝毒性的影响  57-59
    3.3 相关基因表达的定量分析  59-66
      3.3.1 桑根皮素对 P53 基因表达的影响  60-61
      3.3.2 桑根皮素对 Survivin 基因表达的影响  61-62
      3.3.3 桑根皮素对 CyclinB1 基因表达的影响  62-63
      3.3.4 桑根皮素对 Caspase-3 基因表达的影响  63-65
      3.3.5 桑根皮素对 NF-κB 基因的影响  65-66
  4. 讨论  66-69
  5. 结论  69-70
参考文献  70-71
基金资助  71-72
附录一 英汉双解缩略词表  72-73
附录二  73-77
读研期间发表的文章及成果  77-78
致谢  78-79

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