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玉米辐照诱变及遗传转化研究

作　者: 卞喜座
导　师: 安海龙
学　校: 山东农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 玉米辐照转基因
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦和水稻而居第三位。中国年产玉米占世界第二位，是我国第二大粮食作物，面积和总产分别占三大粮食作物（玉米，水稻，小麦）的35%和36%。玉米的应用越来越广泛，玉米的需求也越来越大。特别是做为工业原料和饲料的需求缺口很大。因此获得高产的优良品种也就显得非常重要。近几年来，不少学者对我国玉米种质基础的现状进行了较为详尽的研究，提出了我国玉米育种和生产用种种质主要集中在Reid、Lancaster、唐四平头、旅大红骨和P群等少数杂优类群中，存在种质基础狭窄，遗传多样性匮乏，易诱发突发性病虫害的危险等现实问题。如80年代中期以来的玉米青枯病，90年代以来的玉米病毒病（如粗缩病、花叶病毒和条纹病毒病等），1998年黄淮海夏玉米区的玉米锈病等，都给我国玉米生产造成较大的经济损失，引起全国玉米育种同行的极大关注。辐射能产生新的优良基因型和拓宽变异范围，这对创造新的玉米种质和改善目前种质遗传基础狭窄的状况都是极其重要的。辐射不仅能提高群体各性状的变异性，而且具有提高有益变异频率、加速后代稳定和易于获得高配合力株系等特点，从而表明辐射诱变是玉米种质选育的有效途径。它突破了玉米种质基础狭窄的限制，并且可以获得大量的诱变突变体，一方面可以直接育种，另一方面也可以作为杂交育种的亲本。而且将突变体材料作为父本通过与野生型连续回交可获得单一性状突变体，为从分子水平进行研究奠定了基础。转基因育种是直接将外源基因直接导入植物中进行表达，从而获得某些优良性状的育种技术。这种育种方式也突破了传统育种的樊篱，而且能够获得植物本身不具有的优良性状，是植物育种的一种重要途径。转基因植物研究越来越成为更多国家农业生物技术的重点方向。玉米是是植物转基因研究十分活跃的领域。抗虫和抗除草剂转基因玉米已经商业化生产，并取得了十分明显的经济效益。本实验即通过这两大方向进行研究。一方面为玉米辐照诱变。优良玉米自交系昌7-2自育成以来已被多家育种单位引进和利用，组配出许多优良玉米新组合，在生产上大面积推广应用，为我国玉米生产做出了巨大贡献。当然昌7-2也有缺点，这些缺点是,根系发育差,不抗根倒伏,穗位过高,成熟偏晚,叶片较宽大,穗上部分过于繁茂。本实验通过60Co-γ辐照优良玉米自交系昌7-2获得了大量的突变体材料，为种质创新打下了基础，同时通过突变体材料与昌7-2的连续回交获得单一性状突变体，进而为从分子水平上的基因定位奠定了基础，也为进一步阐明某些性状是由哪些基因控制奠定了基础，更为获得直接应用于生产的优良品种打下了基础。另一方面为玉米转基因。CYP735A与DWARF4这两种基因分别是控制细胞分裂素与BR激素合成的关键酶之一。在所有细胞中适当过量表达这两种基因，有可能提高细胞分裂能力而不改变分化能力，延缓花期和苗期的衰老，导致作物产量提高。如果在根系中适量表达CYP735A和DWARF4两种基因，就有可能引起植物花期后根系衰老的延迟，从而延迟功能叶的衰老，进而促进植物产量的提高（植物授粉后灌浆期衰老的产生是由于授粉后一定时间内产生了一个发育生物学信号，该信号传导到根，引起根系衰老，根系的衰老引起地上部功能叶的衰老）。利用农杆菌介导法将CYP735A与DWARF4这两种基因转到玉米中，并利用构建的适量表达的载体，让基因在玉米中适量表达，可以增大玉米植株的生物量和玉米的产量而不引起玉米形态的巨变。本实验利用农杆菌介导法进行了玉米转化方面的研究，同时对农杆菌介导的转化体系进行优化，为下一步获得转基因植株创造了条件。

全文目录

中文摘要  10-12
Abstract  12-15
1 前言  15-29
  1.1 玉米概况  15-17
  1.2 诱变育种  17-20
    1.2.1 诱变育种机理  17-18
    1.2.2 诱变育种的成就  18-19
    1.2.3 诱变材料的选择和诱变剂量的选择  19
    1.2.4 辐照方法的选择  19
    1.2.5 诱变育种存在的问题  19
    1.2.6 诱变后代的处理  19-20
  1.3 辐照诱变材料昌 7-2  20-21
    1.3.1 昌 7-2 介绍  20
    1.3.2 昌 7-2 生物学性状  20-21
    1.3.3 昌 7-2 的典型遗传性状  21
  1.4 转基因育种即基因工程育种  21-27
    1.4.1 转基因育种机理  21-22
    1.4.2 控制基因微量表达的手段  22
    1.4.3 转基因玉米  22-23
    1.4.4 农杆菌介导的转基因玉米  23-27
      1.4.4.1 农杆菌介导转基因法应用于玉米遗传转化的发展史  23-25
      1.4.4.2 农杆菌介导玉米遗传转化技术现状  25-27
      1.4.4.3 农杆菌介导的玉米遗传转化技术展望  27
  1.5 实验目的和意义  27-29
    1.5.1 玉米昌 7-2 辐照诱变育种的目的和意义  27-28
    1.5.2 玉米转基因育种目的和意义  28-29
2 材料与方法  29-42
  2.1 实验材料  29-30
    2.1.1 植物材料及生长条件  29
    2.1.2 菌株和载体  29
    2.1.3 酶及相关生化试剂  29
    2.1.4 玉米组培培养基  29-30
  2.2 试验方法  30-42
    2.2.1 玉米辐照诱变试验方法  30-31
      2.2.1.1 昌 7-2 玉米种子的处理方法  30
      2.2.1.2 材料种植方法  30
      2.2.1.3 研究方法  30-31
        2.2.1.3.1 生长发育观察  30
        2.2.1.3.2 经济性状考察  30-31
    2.2.2 玉米遗传转化试验方法  31-42
      2.2.2.1 质粒 DNA 的提取  31-32
        2.2.2.1.1 碱法小量提取质粒 DNA  31
        2.2.2.1.2 试剂盒质粒微量提取方案  31-32
      2.2.2.2 PCR 扩增与电泳目的片段的回收  32-33
      2.2.2.3 DNA 片段与载体的连接  33-34
        2.2.2.3.1 DNA 片段与克隆载体的连接  33
        2.2.2.3.2 DNA 片段与表达载体的连接  33-34
      2.2.2.4 大肠杆菌感受态细胞制备  34
      2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化  34
      2.2.2.6 根癌农杆菌 LBA4404/GV3101 感受态细胞的制备  34-35
      2.2.2.7 冻融法转化农杆菌  35
      2.2.2.8 表达载体的构建  35-39
        2.2.2.8.1 XB11 载体的构建  35-36
        2.2.2.8.2 XB9 载体的构建  36
        2.2.2.8.3 XB10 载体的构建  36-37
        2.2.2.8.4 XB4 载体的构建  37
        2.2.2.8.5 XB8 载体的构建  37
        2.2.2.8.6 XB2 载体的构建  37-38
        2.2.2.8.7 XB6 载体的构建  38
        2.2.2.8.8 XB3 载体的构建  38
        2.2.2.8.9 XB7 载体的构建  38-39
        2.2.2.8.10 XB1 载体的构建  39
        2.2.2.8.11 XB5 载体的构建  39
      2.2.2.9 农杆菌介导的玉米遗传转化  39-41
      2.2.2.10 玉米遗传转化体系的优化  41
        2.2.2.10.1 幼胚放置方向对于愈伤诱导的影响  41
      2.2.2.11 GUS 染色分析  41-42
3 结果与分析  42-52
  3.1 玉米辐照诱变结果分析  42-50
    3.1.1 随辐射量增加，M1 代的出苗率和成苗率降低  42
    3.1.2 M2 代的分离和选择  42-48
      3.1.2.1 随辐射量的增加，在 M2 代出现变异的几率越大  42-43
      3.1.2.2 选取的优株类突变材料表型  43-45
      3.1.2.3 选取的劣株类突变材料表型  45-46
      3.1.2.4 选取的优穗类突变材料表型  46-47
      3.1.2.5 选取的劣穗类突变材料表型  47-48
    3.1.3 M3 代后的分离和选择  48-50
  3.2 玉米遗传转化结果分析  50-52
    3.2.1 各个载体的构建结果  50-51
    3.2.2 表达载体转化玉米  51
    3.2.3 玉米农杆菌侵染转化体系的优化  51-52
      3.2.3.1 幼胚放置方向对于愈伤诱导的影响  51-52
4 讨论  52-54
  4.1 玉米辐照诱变  52
  4.2 玉米遗传转化  52-54
    4.2.1 农杆菌介导的玉米遗传转化技术中存在的问题分析  52-54
      4.2.1.1 农杆菌方面的各因素分析  52-53
      4.2.1.2 玉米受体再生体系及培养环境方面的各因素分析  53-54
5 结论  54-56
  5.1 玉米辐照诱变  54-55
    5.1.1 辐照剂量对后代影响  54-55
    5.1.2 突变体材料  55
    5.1.3 突变体材料回交  55
  5.2 玉米遗传转化  55-56
    5.2.1 构建载体  55
    5.2.2 农杆菌侵染玉米遗传转化体系的优化  55-56
参考文献  56-63
致谢  63

玉米辐照诱变及遗传转化研究

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