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稻纵卷叶螟鱼尼丁受体基因和钠离子通道基因的克隆与选择性剪接分析

作　者: 李艳青
导　师: 王建军
学　校: 扬州大学
专　业: 农药学
关键词: 稻纵卷叶螟鱼尼丁受体钠离子通道选择性剪接 RT-PCR RACE
分类号: S435.112.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

稻纵卷叶螟Cnapha locrocismedinalis Guenee(鳞翅目Lepidoptera,螟蛾科Pyralididae),是亚热带国家水稻Oryza sativa (L.)(禾本目Poaceae,禾本科Graminales)最严重的食叶害虫之一。近年来,稻纵卷叶螟在我国南方以及长江中下游稻区的发生和危害日趋严重。目前化学防治仍是有效控制稻纵卷叶螟为害的主要手段。随着害虫对现有杀虫剂抗性的快速发展,研发具有新型作用机制的杀虫剂至关重要。本文克隆了稻纵卷叶螟鱼尼丁受体和钠离子通道基因,分析了鱼尼丁受体和钠离子通道基因剪接异构体在稻纵卷叶螟不同发育阶段和成虫不同组织部位的表达模式,研究结果对于进一步丰富对昆虫鱼尼丁受体和钠离子通道结构和功能关系的认识以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和实践价值。鱼尼丁受体(ryanodine receptor, RyRs)是一类控制Ca2+从胞内钙库释放的配基门控钙离子通道。RyRs是两类新型化学合成杀虫剂邻苯二甲酰胺类和邻甲酰氨基苯甲酰胺类的作用靶标。RyRs全长cDNA克隆是了解昆虫RyRs结构和功能特性以及二酰胺类杀虫剂选择性作用机制的关键。本文通过反转录多聚酶链式反应技术(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了稻纵卷叶螟RyR全长cDNA,命名为CmRyR。CmRyR开放阅读框长15264bp,编码5087个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为574339Da。氨基酸序列比对表明,CmRyR与家蚕和果蝇的RyR序列一致性分别为94%和79%。CmRyR与已知RyRs具有共同的结构特征。分别位于CmRyR蛋白C末端4183-4194位和4285-4296位的两个EF-hands表明CmRyR与哺乳动物RyRs一样,可以调节细胞内Ca2+释放。CmRyR在通透离子的包括选择性滤孔基序(GGGXGD)的孔道区与哺乳动物RyRs高度相似,表明CmRyR可形成功能性Ca2+通道。多重序列比对表明,对应于CmRyR N4922,N4924,N4935,L4950,L4981,N5013和T5064的氨基酸残基在鳞翅目昆虫中完全一致,相应位置的与鳞翅目昆虫不同的氨基酸残基在非鳞翅目昆虫和其他无脊椎动物以及脊椎动物RyRs中高度保守,推测这些氨基酸残基可能在鳞翅目和非鳞翅目昆虫RyRs通道特性差异以及二酰胺类杀虫剂选择性毒性方面具有重要作用。此外,在CmRyR基因中发现两个选择性剪接位点,其中之一位于第二个SPRY结构域中央部分。特异性PCR检测表明,互斥外显子(a/b)的表达具有发育阶段和组织特异性。在卵和成虫头部的所有cDNA克隆中都检测到外显子a,但蛹的23个cDNA克隆中和成虫身体的21个cDNA克隆中分别检测到16和11个外显子a。相反,外显子b在卵和成虫头部没有检测到,但在蛹和成虫身体中低至中等频率表达(30%和48%)。另外,选择性外显子c的表达也具有发育阶段特异性。在卵、3龄幼虫和5龄幼虫中,外显子c低频率(0%,17%和10%)表达,但在1龄幼虫和蛹中,外显子c中等至高频率(55%和71%)表达。这些结果表明选择性剪接可能是稻纵卷叶螟以及其他昆虫RyR通道产生功能多样性的主要方式。电压门控钠离子通道是拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标,昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的一个重要机制称为击倒抗性。钠离子通道在害虫抗药性中的重要作用推动了昆虫钠离子通道的研究。新型高效杀虫剂茚虫威作用于失活态钠离子通道,破坏神经冲动传递,是替代有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂的理想品种,目前已经在我国部分地区用于稻纵卷叶螟的防治。本文利用RT-PCR和RACE克隆获得了稻纵卷叶螟钠离子通道基因5773bp的cDNA片段,编码1921个氨基酸残基,命名为Cmsc。多重序列比对分析表明,Cmsc与家蚕Bmsc、果蝇para和德国小蠊BgNav氨基酸的序列一致性分别为90%、72%和76%。此外在Cmsc中发现两个选择性剪接位点,分别对应于果蝇para中的互斥外显子k/1和选择性外显子b。特异性PCR检测表明,Cmsc剪接异构体在稻纵卷叶螟不同发育阶段和成虫不同组织部位的表达存在差异。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
第一章文献综述  9-19
  1 昆虫鱼尼丁受体研究进展  9-13
    1.1 鱼尼丁受体概述  9
    1.2 鱼尼丁受体的结构与功能  9-11
    1.3 鱼尼丁与鱼尼丁受体的作用  11
    1.4 昆虫鱼尼丁受体  11-12
    1.5 作用于鱼尼丁受体的新型杀虫剂  12-13
  2 昆虫钠离子通道研究进展  13-18
    2.1 钠离子通道概述  13
    2.2 钠离子通道的结构与功能  13-14
    2.3 昆虫钠离子通道  14-15
    2.4 昆虫钠离子通道与击倒抗性  15-17
    2.5 昆虫钠离子通道基因的选择性剪接  17-18
  3 本文研究目的和意义  18-19
第二章稻纵卷叶螟鱼尼丁受体基因的克隆与序列分析  19-41
  1 材料与方法  20-24
    1.1 供试虫源  20
    1.2 主要试剂和仪器  20-21
      1.2.1 主要试剂  20
      1.2.2 主要仪器  20-21
    1.3 试验方法  21-24
      1.3.1 RNA提取及反转录  21
        1.3.1.1 总RNA提取  21
        1.3.1.2 第一链cDNA合成  21
      1.3.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)  21
      1.3.3 cDNA末端快速扩增(RACE)  21-22
      1.3.4 感受态细胞制备  22-23
      1.3.5 连接反应  23
      1.3.6 连接产物的转化  23
      1.3.7 α互补法进行重组质粒的筛选  23-24
      1.3.8 PCR产物克隆  24
      1.3.9 序列分析  24
  2 结果与分析  24-39
    2.1 稻纵卷叶螟鱼尼丁受体基因(CmRyR)全长cDNA克隆  24-34
    2.2 CmRyR结构域预测  34-35
    2.3 CmRyR C末端分析  35-39
  3 讨论  39-41
第三章稻纵卷叶螟鱼尼丁受体基因的选择性剪接  41-46
  1 材料与方法  41-43
    1.1 供试虫源  41
    1.2 主要试剂和仪器  41
    1.3 试验方法  41-43
      1.3.1 总RNA提取  41
      1.3.2 RT-PCR  41-42
      1.3.3 特异性PCR检测  42-43
  2 结果与分析  43-44
    2.1 选择性剪接外显子的确认  43
    2.2 选择性剪接外显子的表达模式  43-44
  3 讨论  44-46
第四章稻纵卷叶螟钠离子通道基因的克隆与序列分析  46-56
  1 材料与方法  46-48
    1.1 供试虫源  46
    1.2 主要试剂和仪器  46-47
    1.3 试验方法  47-48
      1.3.1 RNA提取及反转录  47
        1.3.1.1 总RNA提取  47
        1.3.1.2 第一链cDNA合成  47
      1.3.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)  47-48
      1.3.3 cDNA末端快速扩增(RACE)  48
      1.3.4 PCR产物克隆和测序  48
      1.3.5 序列分析  48
  2 结果与分析  48-54
    2.1 钠离子通道基因cDNA片段克隆  48-52
    2.2 Cmsc同源性和系统发生分析  52
    2.3 Cmsc结构域预测  52-54
  3 讨论  54-56
第五章稻纵卷叶螟钠离子通道基因的选择性剪接  56-61
  1 材料与方法  56-58
    1.1 供试虫源  56
    1.2 主要试剂和仪器  56
    1.3 试验方法  56-58
      1.3.1 总RNA提取  56
      1.3.2 RT-PCR  56-57
      1.3.3 特异性PCR检测  57-58
  2 结果与分析  58-59
    2.1 选择性剪接外显子的确认  58
    2.2 选择性剪接外显子的表达模式  58-59
  3 讨论  59-61
参考文献  61-77
致谢  77-78
攻读硕士期间发表的学术论文目录  78-79

稻纵卷叶螟鱼尼丁受体基因和钠离子通道基因的克隆与选择性剪接分析

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