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金黄色葡萄球菌液体发酵制备荚膜多糖

作　者: 杨盛永
导　师: 包永明
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物工程
关键词: 金黄色葡萄球菌 荚膜多糖 液体发酵 纯化
分类号: TQ929
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)是一种能够引起人体和动物各种感染的条件致病菌,其主要致病因子之一是其细胞壁外面的一层保护膜——荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CP)。本研究选取表达血清型5型荚膜多糖的金黄色葡萄球菌,以菌体生长量、多糖产量为指标,通过摇瓶发酵、5L发酵罐发酵条件优化高密度培养菌体,并尝试对菌体表达的荚膜多糖进行分离纯化。通过考查乳糖浓度、酵母提取物浓度、初始pH及装液量对S. aureus荚膜多糖产量的影响,得到优化的摇瓶发酵条件为：培养基组成,蛋白胨1.0%(w/v), NaCl0.5%(w/v),乳糖0.2%(w/v),酵母提取物0.4%(w/v),pH7.5,装液量为100ml/500ml,转数180rpm,37℃培养10h,OD600可达2.52,产糖量可达32.77mg/L,分别为优化前的1.46倍和3.29倍。确定发酵罐发酵培养基组成,获得优化的分批发酵条件为：培养基组成为谷氨酸1.3g/L,胱氨酸0.012g/L, MaCl2·6H2O0.4g/L, Na2HPO4·12H2O5.7g/L, NH4C16g/L KC10.09g/L, NaC16g/L,乳糖2g/L,酵母提取物4g/L,烟酰胺0.001g/L,pH7.5；通气量3L/min,转速100rpm,pH7.5。在此条件下发酵培养36h,OD600可达5.05,发酵液中总糖含量达到了56.67mg/L,分别为摇瓶发酵的2倍和1.73倍。通过对金黄色葡萄球菌5L发酵罐分批发酵的分析,确定采用流加补料分批发酵工艺来进一步提高多糖产量。流加工艺为用含有20%乳糖的发酵培养基作为流加物料,以15ml/h(3g乳糖/h)的速度流加66h,共补加乳糖198g,OD600可达9.43,总糖含量达到101.49mg/L,分别为摇瓶发酵的3.74倍和3.1倍。对发酵得到的菌体进行高压蒸汽裂解,裂解液通过CTAB沉淀、CaCl2解离、30%和80%乙醇分级沉淀、DNase及RNase酶解核酸、链霉蛋白酶酶解蛋白、NaIO4氧化磷壁酸、透析冻干等措施对样品进行预处理,利用DEAE-FF离子交换柱尝试进行多糖的分离纯化。液体发酵金黄色葡萄球菌有效解决了固体发酵制备荚膜多糖产量偏低的问题,有助于实现荚膜多糖结合疫苗的商业化生产。减少荚膜多糖损失、除尽干扰杂质及特异性检测多糖的方法对成功分离纯化荚膜多糖是至关重要的。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-12
1 文献综述  12-34
  1.1 金黄色葡萄球菌研究进展  12-14
    1.1.1 金黄色葡萄球菌  12
    1.1.2 金黄色葡萄球菌致病性及流行现状  12-13
    1.1.3 金黄色葡萄球菌致病因子种类及生化特征  13-14
  1.2 金黄色葡萄球菌荚膜多糖基本性质  14-26
    1.2.1 荚膜多糖血清学  14
    1.2.2 荚膜多糖化学结构  14-16
    1.2.3 荚膜多糖的免疫学特性  16-20
    1.2.4 荚膜多糖表达的分子生物学  20-26
  1.3 荚膜多糖表达的影响因素  26-28
    1.3.1 生物体外荚膜多糖表达  26-27
    1.3.2 生物体内荚膜多糖表达  27-28
  1.4 荚膜多糖的检测  28
  1.5 荚膜多糖的分离纯化  28-32
    1.5.1 荚膜多糖的提取  28-29
    1.5.2 荚膜多糖的除杂  29-31
    1.5.3 荚膜多糖的纯化  31-32
  1.6 立题背景及意义  32-33
  1.7 研究内容  33-34
2 血清型5型金黄色葡萄球菌摇瓶发酵条件优化  34-43
  2.1 引言  34
  2.2 材料和方法  34-37
    2.2.1 菌株  34
    2.2.2 实验材料和试剂  34
    2.2.3 主要仪器  34
    2.2.4 主要实验方法  34-37
  2.3 结果与讨论  37-42
    2.3.1 菌种的初步鉴定  37-38
    2.3.2 乳糖含量对金黄色葡萄球菌生长的影响  38-39
    2.3.3 酵母提取物对金黄色葡萄球菌生长和产糖影响  39-40
    2.3.4 培养基初始pH对荚膜多糖产量的影响  40
    2.3.5 装液量对荚膜多糖产量的影响  40-41
    2.3.6 金黄色葡萄球菌的发酵代谢曲线  41-42
  2.4 本章小结  42-43
3 发酵罐培养金黄色葡萄球菌  43-49
  3.1 引言  43
  3.2 材料与方法  43-44
    3.2.1 实验材料和试剂  43
    3.2.2 主要仪器  43
    3.2.3 主要实验方法  43-44
  3.3 结果与讨论  44-48
    3.3.1 分批发酵工艺参数的确定  44-47
    3.3.2 5L发酵罐流加补料分批发酵  47-48
  3.4 本章小结  48-49
4 金黄色葡萄球菌血清型5型荚膜多糖的提取与纯化  49-58
  4.1 引言  49
  4.2 材料与方法  49-52
    4.2.1 实验材料与试剂  49
    4.2.2 实验仪器  49
    4.2.3 主要实验方法  49-52
  4.3 结果与讨论  52-57
    4.3.1 荚膜多糖的提取及除杂  52-56
    4.3.2 荚膜多糖的上柱分离纯化  56-57
  4.4 本章小结  57-58
结论  58-59
参考文献  59-63
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  63-64
致谢  64-65

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 其他发酵工业
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