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盾叶薯蓣SMT基因克隆、表达及其低表达转基因植株的培育

作　者: 金亮
导　师: 陈永勤
学　校: 湖北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 盾叶薯蓣薯蓣皂甙元生物合成 SMT 基因克隆与表达转基因植株
分类号: S632.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

薯蓣皂甙元(皂素)是世界上合成甾体激素类药物最重要的原料,其产品达到200多种。盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C. H. Wright)为我国特有,一直是我国生产皂素的主要原料。长期采挖导致其野生枯竭,远远不能满足皂素生产的需求,人工栽培的盾叶薯蓣已经成为皂素生产的主要原料。但是人工栽培的盾叶薯蓣块茎中薯蓣皂甙元的含量普遍比较低,因此,有必要加强盾叶薯蓣遗传改良、提高其薯蓣皂甙元合成能力。利用植物分子生物学与转基因技术调控盾叶薯蓣皂素生物合成途径中关键酶基因的表达水平将是提高皂素含量最有效的途径。胆固醇是薯蓣属植物皂素生物合成的前体物质。胆固醇是植物甾醇之一,它与植物体内众多的C24-甲基甾醇和C24-乙基甾醇一样,都是以环阿屯醇为前体延同一条合成途径衍生而来的,只是C24-甲基甾醇和C24-乙基甾醇的合成需要C24甲基转移酶(SMT)的参与,因此,抑制盾叶薯蓣SMT将降低C24-烷基甾醇的合成而有利于胆固醇的合成,从而可促进皂素的合成。研究采用简并RT-PCR技术与RACE技术首次成功克隆了盾叶薯蓣的SMT1基因全长cDNA和SMT2基因3’端cDNA片段。SMT1基因全长cDNA为1459bp,含有一个1002bp的开放阅读框、95bp的5’端非翻译区和362bp的3’端非翻译区。SMT1基因推导编码的蛋白含333个氨基酸残基,其序列与玉米、陆地棉、高粱、大豆、拟南芥等植物SMT1的一致性达到78%-82%,并同样有Region Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ为甾醇底物结合位点,Region Ⅱ为腺苷甲硫氨酸结合位点。所克隆的SMT2基因3’端cDNA片段为769bp,其中3’端非翻译区为151bp,编码区所编码的205个氨基酸残基序列也与其它植物的SMT具有很高的一致性。用荧光实时定量PCR首次分析了盾叶薯蓣四个组成型基因Actinl、Actin2、β-Tubulin及GAPDH在幼叶、成熟叶、茎段和地下块茎中的表达稳定性,结果表明GAPDH基因的表达稳定性最好。以GAPDH为参照基因,用qPCR技术分析了盾叶薯蓣SMT1和SMT2基因在在幼叶、成熟叶、茎段和地下块茎中的表达量差异。结果表明,SMT1基因表达量在嫩叶中最高,其次是成熟叶,再次是茎段,在地下块茎中表达最低；嫩叶SMT1表达量大约为块茎的6倍、为茎段的4.5倍、为成熟叶的2倍；SMT2基因表达量则在成熟叶最高,茎段中最低,成熟叶中表达量为茎段的4倍,为嫩叶和块茎的2倍。构建了盾叶薯蓣SMT1基因反义表达载体anti-SMT1和SMT1基因干扰载体SMT1-KNAi,并通过根癌农杆菌介导的转基因方法分别培育出了转anti-SMT1载体和SMT1-RNAi载体的盾叶薯蓣转基因植株。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-22
  1.1 盾叶薯蓣简介  12-13
    1.1.1 基本生物学特性  12
    1.1.2 盾叶薯蓣地理分布情况  12-13
  1.2 盾叶薯蓣主要的应用价值——薯蓣皂甙元的重要来源  13-14
  1.3 盾叶薯蓣育种改良的研究进展  14-16
  1.4 薯蓣皂甙元的生物合成研究进展  16-21
    1.4.1 植物胆固醇是薯蓣皂甙元生物合成的前体物质  16
    1.4.2 环阿屯醇合酶(CAS)在植物甾醇合成中的重要作用  16-18
    1.4.3 甾醇C24甲基转移酶(SMT)在植物甾醇合成中的重要作用  18-21
  1.5 本研究的目的与意义  21-22
第二章盾叶薯蓣SMT基因cDNA的克隆及序列分析  22-42
  2.1 试验材料  22-24
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株与载体  22
    2.1.3 主要试剂  22
    2.1.4 主要仪器设备  22
    2.1.5 培养基  22-23
    2.1.6 溶液  23-24
  2.2 试验方法  24-32
    2.2.1 盾叶薯蓣总RNA的提取  24-25
    2.2.2 mRNA的反转录  25
    2.2.3 简并引物设计及合成  25-26
    2.2.4 cDNA核心片段的克隆和测序  26-29
    2.2.5 基因特异引物的设计及合成  29-30
    2.2.6 快速扩增cDNA末端(RACE)  30-32
    2.2.7 cDNA全长序列分析  32
  2.3 结果与分析  32-41
    2.3.1 盾叶薯蓣总RNA的提取与检测  32-33
    2.3.2 cDNA核心片段的扩增  33
    2.3.3 SMT1基因全长cDNA和SMT2基因cDNA片段扩增及序列分析  33-41
  2.4 小结  41-42
第三章盾叶薯蓣SMT基因表达差异分析  42-59
  3.1 试验材料  42
    3.1.1 植物材料  42
    3.1.2 主要试剂  42
    3.1.3 主要仪器  42
  3.2 试验方法  42-47
    3.2.1 盾叶薯蓣不同器官总RNA的提取  42
    3.2.2 mRNA的反转录  42
    3.2.3 内参基因简并引物的设计与合成  42-43
    3.2.4 内参基因cDNA片段的克隆和序列分析  43-44
    3.2.5 实时定量PCR引物的设计与合成  44-45
    3.2.6 实时定量PCR反应  45
    3.2.7 实时定量PCR引物扩增效率及特异性分析  45-46
    3.2.8 四个内参基因稳定性分析  46-47
    3.2.9 不同器官中SMT基因mRNA水平表达差异分析  47
  3.3 结果与分析  47-57
    3.3.1 不同器官总RNA的提取与检测  47
    3.3.2 内参基因cDNA片段的克隆  47-49
    3.3.3 实时定量PCR引物扩增效率及特异性分析  49-55
    3.3.4 四个内参基因稳定性分析  55
    3.3.5 不同器官中SMT基因mRNA水平表达差异分析  55-57
  3.4 小结  57-59
第四章盾叶薯蓣SMT1基因反义和干扰载体的构建以及转基因植株的培育  59-76
  4.1 试验材料  59-61
    4.1.1 植物材料  59
    4.1.2 菌株与载体  59
    4.1.3 主要试剂  59-61
    4.1.4 培养基  61
    4.1.5 培养条件  61
  4.2 试验方法  61-68
    4.2.1 SMT1基因开放阅读框序列的克隆  61-62
    4.2.2 SMT1基因反义表达载体的构建  62-63
    4.2.3 人工小分子RNA的设计及其人工前体的克隆  63-66
    4.2.4 SMT1基因RNAi载体的构建  66
    4.2.5 反义及RNAi载体转化根癌农杆菌  66-67
    4.2.6 根癌农杆菌介导盾叶薯蓣的遗传转化  67-68
    4.2.7 转基因植株GUS组织化学染色法鉴定  68
  4.3 结果与分析  68-74
    4.3.1 SMT1基因开放阅读框的克隆  68-69
    4.3.2 反义表达载体的验证  69-70
    4.3.3 人工小分子RNA前体的克隆  70
    4.3.4 RNAi载体的验证  70-73
    4.3.5 盾叶薯蓣愈伤组织的诱导与培养  73
    4.3.6 转基因植株的再生  73
    4.3.7 转基因植株GUS组织化学染色法的鉴定  73-74
  4.4 小结  74-76
第五章讨论与展望  76-79
参考文献  79-85
致谢  85

盾叶薯蓣SMT基因克隆、表达及其低表达转基因植株的培育

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