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环氧水解酶的克隆表达和催化性能研究

作　者: 赵晶
导　师: 许建和
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 巨大芽孢杆菌环氧水解酶基因克隆与表达动力学拆分缩水甘油芳基醚分子对接
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,越来越多的全基因组序列陆续公布,加快了目的基因的克隆速度。本课题采用多种基因克隆策略,成功从毛果杨和巨大芽孢杆菌中克隆出多个环氧水解酶(EHs)。通过对巨大芽孢杆菌环氧水解酶(BMEH)的底物谱研究,发现它能够高度对映选择性地催化水解芳基缩水甘油醚类底物,得到高光学纯度的环氧化物或邻位二醇。BMEH催化模型底物苯基缩水甘油醚(PGE)水解拆分的E值达到58,是目前发现的对于该底物选择性最高的天然EH。对于邻位取代的苯基缩水甘油醚和对硝基苯乙烯氧化物,E值超过200。研究中还发现邻位硝基在苯环上的取代(oNPGE)使BMEH的对映选择性发生了剧烈的转换。有趣的是,虽然BMEH对该底物和间位硝基取代时的(mNPGE)选择性相反,但E值都超过200。区域选择性研究表明,BMEH一般主要进攻环氧乙烷环上取代基团较少的碳原子,但对于oNPGE,却反常地主要进攻取代基团较多的碳原子。鉴于oNPGE能够改变BMEH的对映选择性,我们利用分子对接技术在分子水平上成功地解释了这一现象。最后以BMEH粗酶冻干粉为催化剂,实现了五种光学纯环氧化物的百毫克级规模制备。并进一步以邻甲基苯基缩水甘油醚(oMPGE)为例,提高了底物终浓度,得到克级光学纯环氧化物以及光学纯度较高的邻位二醇。表明了BMEH作为生物催化剂,在制备光学纯环氧化物和邻位二醇方面具有潜在的应用前景。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章前言  10-18
  1.1 光学活性环氧化物合成的意义  10-11
  1.2 光学活性环氧化物的制备  11-12
  1.3 环氧水解酶  12-16
    1.3.1 已经克隆表达的EHs  13-14
    1.3.2 底物类型  14-15
    1.3.3 酶的结构与催化机理  15
    1.3.4 EHs在有机合成中的应用  15-16
  1.4 本课题的意义与研究思路  16-18
第2章毛果树环氧水解酶基因的克隆与表达  18-25
  2.1 材料与方法  18-22
    2.1.1 主要试剂  18
    2.1.2 主要仪器和分析软件  18-19
    2.1.3 培养基  19
    2.1.4 毛果杨环氧水解酶基因的克隆  19-21
    2.1.5 目的蛋白的诱导表达  21
    2.1.6 环氧化物的酶促水解  21-22
  2.2 结果与讨论  22-24
    2.2.1 基因的选取和PCR结果  22
    2.2.2 表达载体的构建  22-23
    2.2.3 重组蛋白的诱导表达  23-24
    2.2.4 环氧化物的酶促水解  24
  2.3 本章小结  24-25
第3章巨大芽孢杆菌环氧水解酶基因的克隆表达  25-36
  3.1 基因克隆策略  25
  3.2 材料与方法  25-30
    3.2.1 菌株和培养基  25-26
    3.2.2 巨大芽孢杆菌环氧水解酶的克隆  26-27
    3.2.3 重组酶诱导表达的优化  27-28
    3.2.4 重组酶的纯化  28
    3.2.5 分析方法  28-30
  3.3 结果与讨论  30-35
    3.3.1 巨大芽孢杆菌环氧水解酶基因的预测  30-31
    3.3.2 基因组DNA的提取  31-32
    3.3.3 PCR扩增  32
    3.3.4 重组质粒的构建  32-33
    3.3.5 重组酶诱导表达的优化  33-34
    3.3.6 BMEH的纯化  34
    3.3.7 BMEH的亚基数目  34-35
  3.4 本章小结  35-36
第4章环氧水解酶BMEH底物谱的研究  36-51
  4.1 材料与方法  36-39
    4.1.1 主要试剂、仪器和分析软件  36-37
    4.1.2 培养基  37
    4.1.3 外消旋环氧化物的化学合成  37
    4.1.4 重组BMEH的制备  37-38
    4.1.5 分析方法的建立  38
    4.1.6 绝对构型的确定  38
    4.1.7 酶促系列环氧化物水解拆分  38-39
    4.1.8 BMEH的同源模建  39
    4.1.9 分子对接研究  39
  4.2 结果与讨论  39-50
    4.2.1 消旋环氧化物的合成  39-40
    4.2.2 重组BMEH的制备  40
    4.2.3 标准曲线和手性分析条件  40-41
    4.2.4 底物谱的研究结果  41-44
    4.2.5 区域选择性因子测定  44-45
    4.2.6 同源模建  45-48
    4.2.7 分子对接研究  48-50
  4.3 本章小结  50-51
第5章 BMEH高效催化制备光学纯环氧化物  51-54
  5.1 材料与方法  51
    5.1.1 半制备规模的酶促水解拆分  51
    5.1.2 克级规模生物水解制备(S)-2和(R)-2d  51
  5.2 结果与讨论  51-53
  5.3 本章小结  53-54
全文总结与展望  54-56
参考文献  56-63
附录  63-76
攻读硕士期间撰写的论文和专利  76-77
致谢  77

环氧水解酶的克隆表达和催化性能研究

内容摘要

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