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三叶草斑潜蝇单克隆抗体的制备及其初步应用

作　者: 郭伟
导　师: 赵伟春
学　校: 浙江中医药大学
专　业: 生物化工
关键词: 三叶草斑潜蝇单克隆抗体酶联免疫吸附试验 DNA条形码 ITS1序列 COI序列
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的以三叶草斑潜蝇(Liriomyza trifolii)为抗原,制备单克隆抗体(Monoclonal antibody,简称单抗),利用生物学技术研究单抗的特性,优化间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测实验条件,建立一套完整的间接ELISA检测方法鉴定三叶草斑潜蝇。通过比较DNA条形码鉴定法和ELISA检测方法的优缺点,明确ELISA检测方法的优势。采集2012年4月-11月份杭州市区及周边县市田间蔬菜样本,利用基于三叶草斑潜蝇单抗建立的间接ELISA检测方法实现对田间三叶草斑潜蝇种群发生动态的监测,为三叶草斑潜蝇的防治提供实验依据。方法①应用杂交瘤技术,以三叶草斑潜蝇蛹作为抗原,制备针对三叶草斑潜蝇的单抗。②采用Western blot、间接ELISA等生物学技术,研究三叶草斑潜蝇单抗的结合蛋白、效价、特异性、灵敏度、最佳工作浓度、亚类等特性。③以三叶草斑潜蝇蛹做为抗原,豌豆彩潜蝇做为阴性对照,倍比稀释,确定三叶草斑潜蝇幼虫、蛹、成虫样品检测的最佳稀释倍数。④提取了三叶草斑潜蝇基因组DNA,以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)及内转录第一间隔区(ITS1)序列做为DNA条形码,通过PCR扩增了三叶草斑潜蝇COI和ITS1序列的部分片段,经测序、拼接后,与Genbank中三叶草斑潜蝇、美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)、南美斑潜蝇(Liriomyza huidobrenisis)、豌豆彩潜蝇(Chromatomyia horticola)的COI及ITS1序列进行比对,并进行遗传分析。同时比较DNA条形码鉴定法与间接ELISA检测法鉴定三叶草斑潜蝇的优缺点。⑤采集2012年4月～11月杭州市余杭区、滨江区、西湖区及富阳市等地青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣、蒿菜和芥菜等蔬菜作物叶片上的潜叶蝇样本,利用已建立的间接ELISA检测方法鉴定,监测各地田间三叶草斑潜蝇的发生量在潜叶蝇中的比例,从而为三叶草斑潜蝇的发生规律研究和防治提供实验依据。结果①应用杂交瘤技术,筛选获得了一株能够稳定分泌三叶草斑潜蝇单抗的杂交瘤细胞株4C9F2。制备并获得腹水型单抗100mL。②采用间接ELISA方法检测三叶草斑潜蝇单抗与南美斑潜蝇幼虫、蛹、成虫在490nm波长的OD值分别为0.267、0.233和0.271,与豌豆彩潜蝇幼虫、蛹和成虫在490nm处的OD值分别为0.221、0.204、0.229。与三叶草斑潜蝇幼虫、蛹和成虫抗原在490nm处的OD值为0.760、0.880、0.698。腹水型单抗的效价为8.192×106。该抗体的检测灵敏度为45.3μ/L。腹水型单抗稀释2×104倍间接ELISA检测的OD值为1.021。4C9F2单抗亚类为IgA。Western blot表明,该单抗能与三叶草斑潜蝇的分子量约为122kDa和68kDa的蛋白条带结合。③田间采集的单头潜叶蝇蛹、幼虫和成虫样品分别用16mL、1mL和500μL包被液研磨后取100μL用于间接ELISA检测,所得检测OD值分别为0.933、1.129、1.047。④COI和ITS1DNA片段作为条形码均可以将三叶草斑潜蝇同其它3种近缘种区分开。对于COI序列,三叶草斑潜蝇与南美斑潜蝇相似度为68%,亲缘关系最近；对于ITS1序列,三叶草斑潜蝇与美洲斑潜蝇相似度为88.5%,亲缘关系最近。⑤田间样品的检测表明,在2010年9月-11月份之间,余杭区、滨江区、西湖区、富阳市等四个区市采集的样品阳性率均在70%-80%之间。在青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣和蒿菜等蔬菜作物上采集的潜叶蝇样品的阳性反应率均在50%以上,但不同农作物间的阳性率差异显著,在芹菜上的阳性反应率最高,达到92.4%。结论①应用杂交瘤技术,筛选获得了一株能够稳定分泌三叶草斑潜蝇单抗的杂交瘤细胞株4C9F2。②该细胞株分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高。在此基础上建立了田间采集的单头潜叶蝇蛹、幼虫和成虫样品分别用16mL、1mL和500μL包被液研磨后取1001μL包被酶标板,单抗稀释20000倍,酶标二抗稀释4000倍的间接ELISA方法用于鉴定田间采集的潜叶蝇是否为三叶草斑潜蝇。③COI和ITS1DNA序列作为DNA条形码和基于单抗的间接ELISA方法均可用于三叶草斑潜蝇的鉴定。但相对而言,DNA条形码鉴定更适于实验室的科学研究。间接ELISA整个过程只需加样操作,技术难度低,适于大量检测田间样本,为实现对外来入侵物种三叶草斑潜蝇的动态检测提供了很好的方法。④在近缘种中,杭州市余杭区、滨江区、西湖区及富阳市的三叶草斑潜蝇多发于9月～11月份。青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣和蒿菜均为三叶草斑潜蝇的寄主植物,其中三叶草斑潜蝇偏好于取食芹菜。

全文目录

目录  3-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-13
第一部分三叶草斑潜蝇单克隆抗体的制备及其特性研究  13-30
  1 材料与方法  13-23
    1.1 材料  13-17
      1.1.1 动物  13
      1.1.2 药品  13-14
      1.1.3 溶液配制  14-17
      1.1.4 器材  17
    1.2 方法  17-23
      1.2.1 抗原的准备  17
      1.2.2 单抗的制备  17-20
      1.2.3 间接ELISA检测  20
      1.2.4 单抗的效价及最佳稀释倍数的测定  20
      1.2.5 单抗特异性的检测  20-21
      1.2.6 单抗检测灵敏度的测定  21
      1.2.7 单抗的类型及亚类鉴定  21
      1.2.8 单抗结合目标蛋白的鉴定  21-22
      1.2.9 三叶草斑潜蝇幼虫、成虫及蛹最佳稀释倍数的确定  22-23
  2 结果  23-28
    2.1 抗原的准备  23
    2.2 杂交瘤细胞株的建立  23-24
    2.3 单抗的效价及最佳稀释倍数测定  24
    2.4 单抗的特异性检测  24-25
    2.5 单抗检测灵敏度的测定  25-26
    2.6 单抗亚类的鉴定  26-27
    2.7 单抗结合目标蛋白的检测  27
    2.8 三叶草斑潜蝇幼虫、成虫及蛹最佳稀释倍数的确定  27-28
  3 分析与讨论  28-30
第二部分三叶草斑潜蝇DNA条形码鉴定和ELISA检测方法的比较  30-40
  1 材料与方法  30-33
    1.1 材料  30-32
      1.1.1 昆虫  30
      1.1.2 药品  30-31
      1.1.3 器材  31-32
    1.2 方法  32-33
      1.2.1 样品处理  32
      1.2.2 DNA条形码鉴定  32-33
      1.2.3 ELISA检测  33
      1.2.4 DNA条形码鉴定与ELISA检测法的比较  33
  2 结果  33-38
    2.1 CO1及ITS1序列测序分析  33-35
    2.2 遗传距离分析  35-36
    2.3 系统发育树的构建  36-37
    2.4 ELISA检测  37
    2.5 DNA条形码鉴定和ELISA检测方法的比较  37-38
  3 分析与讨论  38-40
第三部分三叶草斑潜蝇间接ELISA检测方法的初步应用  40-47
  1 材料与方法  41-42
    1.1 材料  41-42
      1.1.1 潜叶蝇样品  41
      1.1.2 药品  41
      1.1.3 器材  41-42
    1.2 方法  42
      1.2.1 田间样品的采集  42
      1.2.2 田间样品的预处理  42
      1.2.3 三叶草斑潜頓样品的检测  42
  2 结果  42-46
    2.1 杭州周边地区不同时间采集的潜叶蝇样品的阳性反应率  42-44
    2.2 不同地点采集的潜叶蝇样品的阳性反应率  44-45
    2.3 不同蔬菜采集的潜叶蝇样品的阳性反应率  45-46
  3 讨论  46-47
结论  47-48
参考文献  48-52
致谢  52-53
文献综述  53-60
  参考文献  59-60

三叶草斑潜蝇单克隆抗体的制备及其初步应用

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