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真核原核表达UHRF2各结构域突变体蛋白

作　者: 白露
导　师: 段昌柱
学　校: 重庆医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: UHRF2 结构域突变体 GST
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的构建UHRF2不同结构域缺失突变体表达载体并在真核细胞中表达；构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体，在大肠杆菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定；为进一步研究UHRF2与其它蛋白相互作用位点奠定基础。方法真核表达产物采用缺失体构建策略，根据UHRF2不同结构域位置特征，单个结构域逐一缺失和两个结构域同时缺失，构建5种不同结构域缺失突变体；以重组质粒pCMV-3xFlag-UHRF2为模板，PCR法直接扩增获得△UBL、△RING和△YDG+△RING编码基因，重叠PCR法扩增获得△PHD和△YDG编码基因；双酶切目的基因片段，定向克隆至pCMV-3xFlag真核表达载体中，构建相应重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，双酶切及测序鉴定阳性质粒；转染HEK293细胞，Western blot鉴定产物表达情况。原核表达UHRF2的各个结构域蛋白，采用直接GST融合各个结构域的策略。以pCMV-3xFlag-UHRF2为模板，PCR扩增UHRF2的各个结构域，各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上。用重组载体转化大肠杆菌（BL21菌株），IPTG诱导下表达GST融合蛋白，超声破碎细菌，离心收获蛋白并经Glutathione Sepharose4B球珠亲合纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果真核构建的各个缺失体载体经酶切和测序确认，载体构建正确；各重组载体在转染HEK293细胞后，经免疫印记检测显示UHRF2的各个结构缺失体成功表达。原核构建的各个结构域融合蛋白表达载体经酶切和测序确认，载体构建正确；各重组载体经大肠杆菌BL21菌株表达，纯化的蛋白经蛋白电泳后考马斯亮蓝染色或免疫印记分析后显示各融合蛋白成功表达。结论UHRF2各结构域缺失体的真核表达载体构建成功便于细胞内研究UHRF2各个结构域的功能、UHRF2与其它蛋白在真核细胞内相互作用的位点、UHRF2亚细胞定位。UHRF2各个结构域的GST融合蛋白表达载体的构建成功便于下游GST pull-down实验，来研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域，为了解UHRF2功能打下基础。

全文目录

英汉缩略语名称对照  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-12
第一部分 UHRF2 各结构域缺失体蛋白真核表达载体的构建和表达  12-26
  1 材料与方法  12-20
  2 结果  20-23
  3 讨论  23-24
  4 小结  24
  参考文献  24-26
第二部分 UHRF2 各结构域缺失体蛋白的表达  26-34
  1 材料与方法  26-32
  2 结果  32
  3 讨论  32-33
  4 小结  33
  参考文献  33-34
第三部分 UHRF2 各结构域原核GST融合蛋白表达载体的构建  34-41
  1 材料与方法  34-39
  2 结果  39-40
  3 讨论  40
  4 小结  40-41
第四部分 UHRF2 各结构域原核GST融合蛋白的表达和纯化  41-48
  1 材料与方法  41-45
  2 结果  45-47
  3 讨论  47
  4 小结  47-48
全文总结  48-49
文献综述  49-57
  参考文献  53-57
致谢  57-58
攻读硕士研究生期间发表的文章  58-59

真核原核表达UHRF2各结构域突变体蛋白

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