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虎纹捕鸟蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表达

作　者: 罗玉娇
导　师: 舒衡平; 蒋立平
学　校: 中南大学
专　业: 病原生物学
关键词: 虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ HW11c40突变体 胰蛋白酶抑制活性 真核表达 原核周质表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


研究背景虎纹捕鸟蛛是我国特有的大型有毒蜘蛛。HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅺ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中提取的一种Kunitz型多肽毒素,具有很强的胰蛋白酶抑制作用,研究表明可用于治疗急性胰腺炎,但它同时具有阻断钾离子通道的作用,在动物身上表现出较弱的神经毒性。其胰蛋白酶抑制活性和钾离子通道阻断活性的功能区域相互独立,非常有利于毒素改造。HW11c40是从虎纹捕鸟蛛毒腺中克隆到的一种新型基因,它所编码的Kunitz型多肽毒素和HWTX-XI具有相似的空间结构以及胰蛋白酶抑制关键活性残基K14,但其不具有钾离子通道抑制的关键活性残基R25。推测,HW11c40和HWTX-XI一样具有强大的胰蛋白酶抑制活性,而其钾离子通道阻断活性会更低。有希望通过对HW11c40进行基因改造,消除其钾离子通道阻断活性,研制出治疗急性胰腺炎的高效药物。然而从天然毒液中分离的蜘蛛毒素远远不能满足研究和开发的需要,蜘蛛毒素的获取一直是限制其研究的难题。目前,通过基因工程表达蜘蛛毒素是一种有效的人工获取毒素的方法。研究目的1、探索出适合HWTX-XI表达的表达系统,解决HWTX-XI研究来源问题。2、对HW11c40进行分子改造,以期消除神经毒副作用,提高多肽稳定性,获得专一高效的胰蛋白酶抑制剂。找到适合HW11c40突变体表达的表达系统,为筛选出合适的突变体进而研制出高效的治疗急性胰腺炎及其胰蛋白酶相关性药物奠定基础。研究方法1、PCR克隆出HWTX-XI的片段重组到载体pET-40b(+)中,构建出重组载体,将重组载体转入至大肠杆菌BL21(DE3)进行周质表达,获得HWTX-XI的融合蛋白,通过肠激酶酶切融合蛋白释放出HWTX-XI的目的蛋白、再经镍柱和色谱进一步分离纯化、最终用质谱鉴定。并对表达的条件进行了优化。2、通过PCR定点突变法对HW11c40进行分子改造后,分别转入载体pVT102U/a和pET40b(+)中,构建出其四个突变体[Y35C]、[Y35CD39N]、[RLY56(35) LEC]及[RLY56(10)(35) LETC]的重组载体,再分别通过酿酒酵母S78真核表达系统和大肠杆菌BL21(DE3)原核周质表达系统中进行表达,接着进行分离纯化,最终用质谱鉴定。研究结果1、原核周质表达系统表达出了HWTX-XI融合蛋白,经肠激酶酶切成功释放出目的蛋白,再经质谱鉴定验证其表达成功,样品冻干后最高量达3.4mg/L。HWTX-XI最优表达条件是无IPTG诱导,30度,培养15-20小时。2、对HW11c40进行了成功的突变,并构建出相应的突变体重组载体。酿酒酵母S78真核表达系统只表达出HW11c40的一种突变体[Y35CD39N](HW11c40M2)。BL21(DE3)原核周质表达系统表达出了所有的突变体的融合蛋白,经肠激酶酶切后,Trince SDS PAGE鉴定证实都获得了对应的目的蛋白。其中[Y35C](KpnIHW11c40M1)又经进一步的分离纯化和质谱鉴定,验证其获得表达。研究结论1、首次用该原核周质表达系统高效表达出HWTX-XI,并对表达条件进行了优化,探索出HWTX-XI表达的新途径。2、对HW11c40成功的进行了分子改造,并用原核周质表达系统表达出了以增强多肽稳定性,降低钾离子通道阻断活性,提高胰蛋白酶抑制活性为目的HW11c40的4种突变体多肽毒素,证实此原核周质表达是适合的表达系统。为后期活性研究,筛选出有意义的突变体,继而研制高效治疗急性胰腺炎药物奠定基础。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
中英文缩略词表  14-15
前言  15-19
第一章 真核表达虎纹捕鸟蛛毒素HW11c40的突变体  19-32
  1.1 前言  19-21
  1.2 材料与试剂  21-22
    1.2.1 真核表达质粒与菌株  21
    1.2.2 试剂及仪器  21-22
    1.2.3 真核表达培养基  22
  1.3 实验方法  22-27
    1.3.1 引物设计  22
    1.3.2 PCR定点突变  22-23
    1.3.3 载体和PCR产物的酶切和纯化  23-24
    1.3.4 载体和目的片段连接  24
    1.3.5 重组后的载体转化  24
    1.3.6 菌落PCR及公司测序鉴定  24-25
    1.3.7 多肽毒素的表达  25-26
    1.3.8 蛋白的纯化(离子交换和反相HPLC)  26
    1.3.9 质谱鉴定  26-27
  1.4 实验结果  27-30
    1.4.1 HW11c40突变体的克隆  27
    1.4.2 重组质粒构建后菌落PCR鉴定与公司测序验证  27-28
    1.4.3 分泌表达和纯化结果  28-29
    1.4.4 质谱鉴定  29-30
  1.5 讨论  30-32
    1.5.1 表达载体和表达系统的选择  30-31
    1.5.2 关于HW11c40突变体酿酒酵母表达可行性的探讨  31-32
第二章 原核周质表达HWTX-XI和HW11c40的突变体  32-62
  2.1 前言  32-33
  2.2 材料  33-34
    2.2.1 表达质粒与菌株  33
    2.2.2 试剂及仪器  33-34
  2.3 原核周质表达HWTX-XI和HW11c40突变体的实验方法  34-42
    2.3.1 构建表达载体  34-37
    2.3.2 融合蛋白表达和纯化  37-40
    2.3.3 酶切获取目的蛋白  40-41
    2.3.4 镍柱分离目的蛋白  41
    2.3.5 目的蛋白的纯化  41-42
    2.3.6 质谱鉴定  42
  2.4 用删除突变的方法构建重组载体  42-47
    2.4.1 引物设计  42-43
    2.4.2 PCR克隆毒素片段  43
    2.4.3 载体和PCR产物的酶切  43-44
    2.4.4 载体和目的片段连接  44
    2.4.6 菌落PCR及公司测序鉴定  44
    2.4.7 删除多余氨基酸  44-46
    2.4.8 目的重组载体转化  46-47
    2.4.9 菌落PCR及公司测序鉴定  47
  2.5 HWTX-XI原核周质表达的条件摸索  47-48
    2.5.1 KpnIHWTX-XI的蛋白表达  47
    2.5.2 不同IPTG浓度诱导表达  47
    2.5.3 不同温度对蛋白表达的影响  47
    2.5.4 不同时间对蛋白表达的影响  47-48
  2.6 实验结果  48-57
    2.6.1 以KpnⅠ和XhoⅠ为酶切位点的HWTX-XI及HW11c40突变体的克隆  48
    2.6.2 重组质粒构建后菌落PCR鉴定与公司测序验证  48-49
    2.6.3 删除突变法构建重组载体  49-51
    2.6.4 原核表达和纯化  51-52
    2.6.5 蛋白酶切  52-54
    2.6.6 目的蛋白的分离纯化和质谱鉴定  54-55
    2.6.7 HWTX-XI融合蛋白在不同条件下的表达结果  55-57
  2.7 讨论  57-62
    2.7.1 表达载体和表达系统的选择  57-58
    2.7.2 对HW11c40进行基因突变的根据和意义  58-59
    2.7.3 不同的方法构建重组载体  59
    2.7.4 HWTX-XI和HW11c40的突变体在该系统表达中的特殊性  59
    2.7.5 表达条件优化  59-60
    2.7.6 新表达方法的可行性及意义  60-62
第三章 主要实验结论与进一步研究设想  62-63
  3.1 主要实验结论和意义  62
  3.2 进一步的研究设想  62-63
参考文献  63-70
附录  70-73
综述  73-84
  参考文献  80-84
致谢  84-85
攻读学位论文期间主要研究成果  85

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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