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人PML基因多克隆抗体的制备及其亚细胞结构定位的研究

作　者: 吴先强
导　师: 郭泽坤；雷鸣
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人PML-3 原核/真核表达 多克隆抗体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


早幼粒细胞白血病蛋白核体(Promyelocytic leukaemia nuclear bodies,PML-NBs)是哺乳动物细胞核中的一种亚核结构,广泛参与如转录调节、基因组稳定性、抗病毒感染、抑制肿瘤、细胞凋亡、细胞衰老等许多重要的细胞生命活动。早幼粒细胞白血病蛋白PML(Promyelocytic leukaemil)是成熟PML NB的一种重要分子。SUMO(small ubiquitin-like modifier)是近年来发现的在结构上类似于泛素的一类小分子蛋白质修饰物,SUMO通过对底物赖氨酸残基的修饰,调节蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白亚细胞定位等。PML-NB的形成依赖于SUMO对其3个赖氨酸位点的修饰,被SUMO化修饰后,PML蛋白之间发生相互作用形成聚集体,并募集多种蛋白到其上,如P53,Daxx,SP100,CBP,Mdm2,AP-1,等,这些蛋白在细胞核内发挥着重要功能。本试验以PML家族成员PML-Ⅲ为研究对象。首先通过PCR从pEGFP-PML-Ⅲ扩增PML-Ⅲ1至600bp的基因序列,然后构建了PML-Ⅲ1至600bp的原核表达载体,获得重组质粒pGEX-4T-1(+)-PML-Ⅲ( 1-600);扩增PML-Ⅲ全长基因,构建真核表达载体,获得重组质粒pCMV-HA-PML-Ⅲ、pCMV-Myc-PML-Ⅲ。将pGEX-4T-1(+)-PML-Ⅲ( 1-600)转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot结果表明融合蛋白GST-PML(1~200AA)在BL21 (DE3) plysS中得到了高效表达,融合蛋白表观分子量约为46kDa。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白。以纯化的融合蛋白GST-PMLⅢ(1~200AA)作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,并利用ELISA、Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果说明原核载体构建成功,ELISA结果为阳性,多克隆抗体效价为1:128000;可以特异性识别内源性PMLⅢ蛋白。将真核表达载体pEGFP-C1-PML-Ⅲ利用脂质体转染法转染到Hela细胞中瞬时表达,在荧光显微镜下观察PML-Ⅲ蛋白的亚细胞结构定位。将真核表达载体pDsRed-C1-SUMO-1和pEGFP-C1-PML-Ⅲ利用脂质体转染法共转染到Hela细胞中进行瞬时表达,在荧光显微镜下观察蛋白的共定位情况。结果说明真核载体在Hela细胞内成功表达;PML-Ⅲ蛋白与SUMO-1蛋白共定位在核内。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章 文献综述  9-22
  1.1 关于PML-NBS  9-15
    1.1.1 概念  9-11
    1.1.2 研究进展  11-15
  1.2 蛋白质(类)泛素化  15-21
    1.2.1 蛋白质(类)泛素化的研究进展  15-16
    1.2.2 小泛素类似修饰物SUMO  16-17
    1.2.3 SUMO 化修饰  17-18
    1.2.4 SUMO 化的生物学功能  18-21
  1.3 本研究目的与意义  21-22
第二章 材料与方法  22-37
  2.1 材料  22-26
    2.1.1 实验材料及试剂  22
    2.1.2 试验试剂  22-26
  2.2 主要仪器设备  26-27
  2.3 试验方法  27-37
    2.3.1 技术路线  27
    2.3.2 引物的设计及合成  27-28
    2.3.3 人PMLⅢ基因原核表达载体的构建  28
    2.3.4 用DNA 胶回收试剂盒法从凝胶中回收PCR 产物  28-29
    2.3.5 酶切质粒pGEX-4T-1-PML-Ⅲ的PCR 回收产物  29
    2.3.6 酶切载体质粒pGEX-4T-1 (+)  29
    2.3.7 用DNA 快速纯化回收试剂盒从溶液中回收酶切产物  29
    2.3.8 酶切后PCR 产物与pGEX-4T-1 (+)载体连接  29-30
    2.3.9 Inoue 法制备超级感受态细胞（DH5α）  30
    2.3.10 转化  30-37
第三章 结果  37-47
  3.1 人PMLⅢ基因N 端1-6008P 片段的扩增  37
  3.2 人PMLⅢ基因原核表达载体PGEX-4T-1(+)-PMLⅢ的构建和鉴定  37-38
  3.3 重组质粒PGEX-4T-1(+)-PMLⅢ在大肠杆菌中的表达及纯化  38-39
  3.4 融合蛋白GST-PML 的纯化及融合蛋白酶切鉴定  39-41
  3.5 兔抗人PML 多克隆抗体鉴定  41-42
    3.5.1 ELISA 检测  41
    3.5.2 Western blot 检测  41-42
  3.6 人PML-Ⅲ基因真核表达载体PCMV-MYC/HA- PML-Ⅲ的构建和鉴定  42-44
  3.7 PMLⅢ蛋白在亚细胞结构的定位分布  44-45
  3.8 PMLⅢ蛋白和SUMO 蛋白在细胞内共定位的研究  45-47
第四章 讨论  47-49
  4.1 PMLⅢ基因扩增片段和载体的选择  47
  4.2 原核表达系统的选择  47
  4.3 兔抗人PMLⅢ多克隆抗体的制备  47-48
  4.4 多克隆抗体的鉴定  48
  4.5 SUMO-1 对PML 的修饰  48-49
第五章 总结及展望  49-50
参考文献  50-55
附录  55-62
致谢  62-63
作者简介  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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