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体外扩增骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗脑缺血的实验研究

作　者: 陈镇洲
导　师: 徐如祥
学　校: 第一军医大学
专　业: 神经外科学
关键词: 骨髓基质细胞血管内皮祖细胞脑缺血扩增移植
分类号: R743.3
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

中风是严重危害人类健康的第三大致死疾病,仅次于心脏病和各种癌症之和。目前,溶栓是比较有效的针对脑梗塞的治疗措施,但在临床上,仅有少部分中风患者适合溶栓治疗,绝大多数患者因为缺乏先兆症状等各种原因错过溶栓治疗的最佳时机,导致神经系统发生不可逆的损害。迄今为止,临床上没有任何办法恢复中风后丢失的神经功能。要重建受损的神经网络必须寻找新的替代“管件”,如新的神经细胞、新的血管、新的突触以及新的电兴奋连接。而干细胞因其良好的增殖和分化潜能,成为中风后细胞缺失替代良好的细胞来源。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）是骨髓中保留的一部分未完全分化的原始细胞,能分化成多种类型的间充质细胞,在合适的条件下,也能跨胚层向神经细胞方向分化。BMSCs移植在啮齿类动物脑缺血模型的治疗研究证明BMSCs能够促进脑缺血的修复,这提示BMSCs是中风细胞治疗良好的细胞来源。由于BMSCs在骨髓中数量稀少,因此,为了实现有意义的干细胞移植治疗,必须在体外扩增获得足够的细胞数量。然而,BMSCs在体外扩增过程中,会逐渐发生细胞衰老,细胞的增殖能力、多向分化潜力、甚至归巢的能力都会逐渐下降。血管内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）是源于骨髓的另一类成体干细胞,在治疗性血管再生中起了重要的作用。EPCs在中风的病生过程中有重要的作用,中风病人EPCs的数量较常人有明显的下降,EPCs的水平与Framingham心血管危险指数负相关。而另一方面,脑缺血损伤又能征募血循环中的EPCs参与新血管的再生。这提示了在体外扩增EPCs再自体移植可能是治疗脑缺血的一个新颖有效的策略。EPCs应用的一个主要限制是EPCs在血循环中数量稀少,尤其是中风发生危险性高的病人EPCs的质量和数量均较常人均明显下降。本课题主要研究内容是探讨体外富集、扩增BMSCs和EPCs的策略,并通过移植BMSCs和EPCs,来促进脑缺血后的神经再生、血管再生、以及结构和功能重建,探讨移植治疗的有效性以及作用机制。由于这两种细胞均可以从病人自身获得并用于自体移植,无伦理学以及免疫排斥的问题,因而该治疗策略应该有较好的临床应用前景。本论文包括了三个章节:第一章、骨髓基质细胞体外扩增及诱导分化的实验研究第1节、兔骨髓基质细胞向神经细胞方向分化过程中无端粒酶的表达目的:检测兔骨髓基质细胞（BMSCs）向神经细胞方向分化过程中端粒酶的表达情况,以及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对端粒酶表达的影响。方法:取兔股骨骨髓,密度梯度离心法获取BMSCs。并分作“Control”组、“胶质源性神经营养因子（GDNF,10μg╱L）组。以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”+10%胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。免疫荧光细胞化学鉴定Nestin、NSE、GFAP表达情况。MTT法测细胞生长曲线。流式细胞仪测对数生长期细胞的细胞周期。TRAP-EHSA法检测分化过程中两组细胞的端粒酶活性变化。结果:成功诱导兔BMSCs向神经细胞方向分化,并表达神经前体细胞及成熟神经细胞、神经胶质细胞的标志。未分化的BMSCs及其向神经细胞方向分化过程中未检测到端粒酶的表达。两组细胞生长曲线、所处的细胞周期以及端粒酶活性变化相似。结论:兔BMSCs及其向神经细胞方向分化过程中,无端粒酶活性表达。GDNF对兔BMSCs增殖及端粒酶活性变化无明显影响作用。第2节、核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响目的:研究以最近发展起来的核转染技术转染增强型绿荧光蛋白质粒进行基因修饰对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响。方法:从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以NucleofectorTM技术转染pEGFP-C2（EGFP组）,以同期培养未转染的细胞作为对照组（Control组）。以“CYTOKINE-神经干细胞培养基”+10%胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。流式细胞仪检测转染效率。比较两组细胞的生长增殖以及Nestin、NSE、GFAP抗原的表达情况。结果:在转染后24小时成功发现EGFP的表达。流式细胞仪检测转染效率,发现转染48h EGFP表达率高达38.4%。两组细胞具有相似的形态学变化以及生长曲线。诱导18天,两组细胞NSE、GFAP的表达比例无明显差异。结论:NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法;EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记;核转染pEGFP-C2对兔原代骨髓基质细胞体外增殖及向神经细胞方向分化无明显影响。第3节、用于神经系统疾病治疗的人骨髓基质细胞体外扩增方法的探讨目的:探讨用于神经系统疾病治疗的人骨髓基质细胞体外扩增的方法。方法:分为4组:FBS（L）组（培养基添加2%低浓度胎牛血清FBS）、FBS（H）组（10%高浓度FBS）、bFGF+FBS（L）组（10ng/ml bFGF+2%FBS）、及bFGF+FBS（H）（10ng/ml bFGF+10%FBS）。通过测细胞生长曲线、细胞周期分布以及端粒酶活性来判断各组细胞的增殖活性;检测并比较各组细胞向神经方向分化的能力;以von Kossa染色检测成骨分化,油红O染色检测成脂肪分化。结果:人BMSCs在形态上明显可分为两种类型:小的迅速增殖的梭形细胞和大的扁平状细胞,前者具有更好的分化潜能。FBS和bFGF均能促进入BMSCs的增殖,但是高浓度的FBS能促进细胞向间充质组织（成骨和成脂肪）分化,同时抑制了Nestin的表达,而bFGF则同时有利于保持细胞向神经方向分化的潜能。结论:建立了基于“bFGF+低浓度胎牛血清”的体外扩增用于神经系统疾病治疗的人BMSCs的方法。第二章、人血管内皮祖细胞体外扩增及诱导分化的实验研究第1节、体外扩增源于骨髓的血管内皮样细胞的实验研究目的:探讨从未经选择的粘附的骨髓单个核细胞中富集、扩增血管内皮祖细胞的可行性,建立体外扩增骨髓源性血管内皮样细胞的方法。方法:取人骨髓单个核细胞接种于纤连蛋白包被的培养板,以“低糖DMEM培养液[包含3.97mM的GLUTAMAXTM（L-丙氨酰-L谷氨酰胺二肽）和110g/L丙酮酸钠]+1×胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+10^-8M地塞米松+2%FBS+抗生素”作为分离培养液。以分离培养液+“20ng/ml血管内皮细胞生长因子+5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子+5ng/ml胰岛素样生长因子”作为分化培养液。观察细胞的形态学变化;流式细胞仪和免疫荧光细胞化学检测粘附细胞的表型变化;Heochst33342/PI双染色法检测细胞凋亡;结果:接种于分离培养基的粘附细胞主要表现为骨髓基质细胞的特征;当将骨髓单个核细胞接种于分化培养基,培养前7天可有部分非粘附的细胞可以转化成粘附细胞,形态上则可发现“绳索样结构、血岛样细胞团以及鹅卵石样细胞层”等出现,细胞逐渐表达KDR、vWF和UEA-1等血管细胞标志,至第9天大部分细胞已经表达血管细胞的标志,细胞扩增20代没有发现明显的生长停滞。细胞凋亡的发生率＜1%。结论:建立了简单、有效的源于骨髓单个核细胞的血管内皮细胞前体的体外富集和扩增方法。第2节、源于骨髓的血管内皮样细胞的功能鉴定目的:对源于骨髓单个核细胞的血管内皮样细胞进行功能学鉴定。方法:以上一节建立的方法体外扩增血管内皮样细胞。对这些细胞进行“组胺诱导细胞释放vWF实验、acLDL摄取、结合UEA-1、以及体外管状结构形成实验”分析。透射电镜检测超微结构。通过自体移植兔下肢缺血模型来检测细胞在体内参与血管再生的能力。结果:这些细胞在体外能被组胺诱导释放vWF,能摄取acLDL,结合UEA-1,以及在体外形成管状结构。电镜检查显示这些细胞具有正常血管内皮细胞的超微结构和生理学特征,如Weibel-Palade小体、质膜小泡、胞质突起、扩大的粗面内质网、增大的高尔基体、发达的线粒体以及排列有序的微丝。通过自体移植兔下肢缺血模型证明这些细胞能整合进缺血区的新生血管,参与新血管再生。结论:未经选择的粘附的骨髓单个核细胞能够在体外扩增分化成有功能的血管内皮细胞。第三章、免骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗大脑中动脉阻断模型的研究第1节、兔永久性大脑中动脉阻断模型的建立目的:建立兔永久性大脑中动脉阻断（MCAO）模型,为下一步的细胞移植研究奠定基础。方法:采用显微外科方法眶入路电凝并切断大脑中动脉（MCA）;TTC染色显示缺血灶;以H-E染色、Nissl染色以及电镜来检测脑缺血细胞损害情况;在MCAO后2h、48h和2w,以原位末端标记（TUNEL）法和Hoechst 33342染色来检测凋亡细胞的DNA碎片。结果:阻断MCA在MCA的供血范围造成可靠的、边界清楚的皮层梗死灶。除了细胞死亡,在MCAO后2h、48h和2w三个时间点均发现细胞凋亡,这其中,MCAO 48h凋亡细胞的数量最多。结论:成功地制作了兔永久性MCAO模型;兔永久性MCAO模型存在着细胞凋亡,并至少可持续至缺血后2周。第2节、兔骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗脑缺血的实验研究目的:检验兔骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗局灶性脑缺血的有效性,并探讨可能的治疗机制。方法:兔18只,随机分为Vehicle组、BMSCs组、EPCs组,每组6只,分别在体外扩增BMSCs（BMSCs组）和EPCs（EPCs组）,30天后眶入路法制作兔永久性大脑中动脉阻断模型。模型成功后一天,每只动物通过耳缘静脉移植3×10⁷细胞,而Vehicle组注射同体积PBS。移植后2周,比较神经功能学评分、梗死灶体积、凋亡细胞数量、微血管密度。另取兔4只,免疫组化检测DiO的标记BMSCs和DiI标记的EPCs分化情况。另一只兔,将标记的BMSCs和EPCs混合移植于MCAO对侧半球的侧脑室,检测细胞分布情况。结果:与Vehicle组相比,BMSCs组在功能学评分、细胞凋亡数量、微血管密度差异有统计学意义（P均＜0.05）,而EPCs组在功能学评分、梗死灶体积、细胞凋亡数量、微血管密度差异均有统计学意义（P均＜0.05）。标记的细胞主要分布于梗死灶周围,小部分BMSCs（＜1%）表达NeuN或GFAP,而大部分的EPCs（＞90%）能结合UEA-1,一些细胞已整合进血管。BMSCs、EPCs在移植于损伤对侧的侧脑室,能够向损伤侧移行,穿过室管膜,并向梗死灶迁移。结论:兔BMSCs自体移植能促进MCAO模型的功能恢复,减少细胞的凋亡,促进新血管再生;兔EPCs自体移植能促进MCAO模型的功能恢复,缩小梗死灶的体积,减少细胞的凋亡,参与并促进新血管再生;BMSCs、EPCs经侧脑室注射移植,能够向梗死灶方向迁移,参与损伤修复。

全文目录

中文摘要  3-10
英文摘要  10-21
研究背景  21-27
  1.骨髓基质细胞在脑缺血中的应用  21-22
  2.血管内皮祖细胞在脑缺血中的应用  22-23
  3.开展本课题的总体思路  23-24
  参考文献  24-27
第一章骨髓基质细胞体外扩增及诱导分化的实验研究  27-65
  第1节兔骨髓基质细胞向神经细胞方向分化过程中无端粒酶的表达  28-40
  第2节核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响  40-50
  第3节用于神经系统疾病治疗的人骨髓基质细胞体外扩增方法的探讨  50-61
  参考文献  61-65
第二章人血管内皮祖细胞体外扩增及诱导分化的实验研究  65-94
  第1节体外扩增源于骨髓的血管内皮样细胞的实验研究  66-81
  第2节源于骨髓的血管内皮样细胞的功能鉴定  81-91
  参考文献  91-94
第三章兔骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗大脑中动脉阻断模型的研究  94-122
  第1节兔永久性大脑中动脉阻断模型的建立  95-107
  第2节兔骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗脑缺血的实验研究  107-119
  参考文献  119-122
全文小结  122-123
综述一骨髓基质细胞移植治疗脑缺血  123-133
综述二血管内皮祖细胞及其在脑缺血中的作用  133-142
综述三中枢神经系统损伤后神经再生的策略  142-152
附录(缩略词表)  152-155
成果  155-157
致谢  157-158

体外扩增骨髓基质细胞、血管内皮祖细胞自体移植治疗脑缺血的实验研究

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