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以BMP-2为靶点的抗骨质疏松药物的筛选及其上调剂04-5195A、NO.39、NO.3的体内外活性研究

作　者: 杨兆勇
导　师: 张月琴
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 医科大学 抗骨质疏松药 博士论文 破骨细胞 成骨细胞分化 协和 骨小梁 医学科学 雷洛昔芬 类骨质
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


据估计，世界范围内约有1亿人患有骨质疏松症，因此，寻找新型的抗骨质疏松的药物是一项紧迫的任务。大量研究表明，骨形态形成蛋白因子Ⅱ（BMP-2）可增加骨钙蛋白和成骨细胞分化标志酶碱性磷酸酶等基因的表达，促进骨小节形成及随后的骨层次化，在成骨细胞分化过程中起非常关键的作用。此外，近年来随着对BMP-2作用的分子机制及细胞通路的深入研究，对BMP-2蛋白的功能有了更深入的揭示，发现BMP-2蛋白除了作用于成骨细胞，还可以抑制破骨细胞。Lorenz C et al发现BMP-2（100ng／ml）可提高人胎儿成骨细胞系（hFOB）的OPG mRNA表达。另一些实验也证实了BMP-2可通过与其BMP1A受体的结合，在Smad1的辅助下，作用于Hox结合位点，活化OPG启动子。OPG是新近发现的TNF-R超家族成员，是一种可溶性的诱饵受体，可通过阻断RANKL与RANK结合而抑制破骨细胞形成。鉴于以上最新研究，我们认为以BMP-2为靶点的抗骨质疏松药物筛选模型既可能筛到促进成骨细胞分化的物质也可能筛到抑制破骨细胞活性的物质。本研究室已初步建立了一个以bmp-2启动子为药物作用靶点、荧光素酶基因为报告基因，通过测定模型荧光强度的变化来筛选BMP-2活性上调剂的抗骨质疏松药物筛选模型。应用该筛选模型对本所微生物发酵产物样品库及合成化合物样品库进行了高通量筛选，通过筛选已获得多个阳性菌株及阳性化合物。本论文的第一部分是对过去筛到的阳性菌株04-5195所产生的活性物质进行分离、纯化与结构鉴定。结果表明，活性成分04-5195A与寡肽类抗生素Amicoumacin B同质。并采用半定量RT-PCR技术，在分子水平上验证了04-5195A具有促人骨瘤细胞MG63的BMP-2 mRNA转录的作用。应用流式细胞分析技术，在蛋白水平上进一步证明了04-5195A促MG63细胞的BMP-2的表达。据报道，Amicoumacin B是细菌中的短小芽孢杆菌（Bacillus brevis）产生。Shimojima等曾在小鼠实验中证实了Amicoumacin B对神经紧张引起的胃溃疡有一定的保护作用。Itoh等曾报道Amicoumacin B有抗炎活性。而AmicoumacinB具有上调BMP-2的作用是本研究首次报道的。经鉴别，菌株04-5195为诺卡菌属的一个新种（另文发表），因此，本研究首次发现Amicoumacin B由放线菌产生。论文的第二部分是应用已建立的以bmp-2启动子为靶点的筛选模型对本所的化合物样品库进行筛选，结果获得二个阳性化合物NO.39和NO.3，BMP-2上调率分别为40.31％和34.57％。体外活性研究表明NO.39可促MG63细胞的BMP-2 mRNA的转录和BMP-2表达。体内活性研究采用了切除双侧卵巢的SD大鼠骨质疏松模型。以10mg．d-1．kg-1剂量连续口服给药90天后测定大鼠胫骨近端松质骨静态参数和动态参数，观察骨物理生长指标。结果表明，NO.39和NO.3均能抑制去卵巢大鼠的破骨细胞活性，减轻因骨质转化率增高和骨量下降所致的骨质疏松症状。论文的第三部分建立了测定NO.39血浓度和组织浓度的高效液相分析法，并应用于研究口服给药后NO.39在大鼠体内的药代动力学及组织分布情况。研究结果表明，所建的测量NO.39血浓的HPLC方法，在0.1-75.0μg．mL-1浓度范围内呈现良好的线性关系（r=0.9968）；平均回收率在99.8-103.7％之间。采用上述测定方法研究了NO.39的CL，，t1/2，Tmax和Vdss等主要药动学参数值，结果显示：大鼠口服NO.39 4.0-30.0mg．kg-1后，药物在体内吸收和消除较快，不同剂量给药呈线性药代趋势。所建立的测量大鼠组织中NO.39含量的方法，在0.05-25.0μg．mL-1浓度范围内呈现良好的线性关系（r＞0.992）；平均回收率在99.8-108.5％之间；采用上述测定方法获得了口服给药10.0mg．kg-1后，NO.39在大鼠各组织的浓度分布，发现最高浓度出现在肝脏，其次为肺、肾、脾、心脏，在所研究组织中，未见明显的特殊蓄积现象。以上实验结果证明了本研究所建立的抗骨质疏松药物的体内外筛选模型用于筛选抗骨质疏松药物是可行的，NO.39有望通过进一步的研究，开发成为一个抗骨质疏松的新药。

全文目录


目录  3-7
缩略语一览表  7-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-14
前言  14-18
1 实验材料  18-24
  1.1 主要仪器  18
  1.2 菌株与质粒  18-19
  1.3 细胞株  19
  1.4 培养基  19
  1.5 工具酶和引物  19-20
  1.6 试剂盒  20
  1.7 试剂  20-23
    1.7.1 抗生素  20
    1.7.2 细胞消化使用液  20
    1.7.3 琼脂糖凝胶电泳缓冲液  20-21
    1.7.4 蛋白质电泳缓冲液  21
    1.7.5 Western blot试剂与缓冲液  21-22
    1.7.6 RNA提取液  22
    1.7.7 有机溶剂  22
    1.7.8 流式细胞检测BMP-2试剂与缓冲液  22-23
  1.8 实验动物  23
  1.9 其他材料  23-24
2 实验方法  24-42
  2.1 细胞培养  24-25
    2.1.1 细胞的复苏  24
    2.1.2 细胞的传代  24
    2.1.3 细胞的冻存  24-25
  2.2 荧光素酶检测模型的建立  25
  2.3 pYJ质粒的大量提取  25-27
  2.4 细胞瞬时转染  27-28
  2.5 荧光检测  28
  2.6 SDS-PAGE样品的制备  28
    2.6.1 菌液样品的制备  28
    2.6.2 蛋白质溶液样品的制备  28
  2.7 SDS-PAGE电泳  28-29
  2.8 Westernblot分析  29-30
  2.9 RT-PCR  30-32
    2.9.1 总RNA的提取  30
    2.9.2 引物的设计  30-31
    2.9.3 RT-PCR  31-32
  2.10 流式细胞仪检测BMP-2  32-33
  2.11 模型的应用  33-34
    2.11.1 跟踪活性  33
    2.11.2 合成化合物库的筛选  33-34
  2.12 04-5195发酵液的分离纯化  34-35
    2.12.1 发酵时间的确定  34
    2.12.2 发酵液初提  34-35
    2.12.3 发酵液的大规模提取分离  35
  2.13 04-5195A的鉴定和结构解析  35-36
  2.14 动物骨质疏松模型的构建  36
  2.15 动物给药  36
  2.16 不脱钙骨切片的制作及染色  36
  2.17 骨组织形态计量学指标的测定  36-37
    2.17.1 骨小梁组织形态计量  37
    2.17.2 皮质内表面形态计量  37
  2.18 NO.39的药物动力学研究  37-39
    2.18.1 对照品溶液配制  37
    2.18.2 色谱条件  37-38
    2.18.3 血浆样品采集  38
    2.18.4 血浆样品处理  38
    2.18.5 方法学评价  38-39
    2.18.6 数据分析  39
  2.19 NO.39的组织分布研究  39-42
    2.19.1 对照品溶液配制  39
    2.19.2 色谱条件  39
    2.19.3 组织样品的制备  39-40
    2.19.4 方法学评价  40-41
    2.19.5 药物在大鼠体内的组织分布  41-42
3 实验结果  42-73
  3.1 04-5195立瓶发酵时间的确定  42
  3.2 04-5195发酵液的分离提取  42-44
    3.2.1 分离纯化流程  42-44
    3.2.2 纯度分析  44
  3.3 04-5195A的理化性质和结构解析  44-46
    3.3.1 理化性质  44
    3.3.2 结构解析  44-46
  3.4 04—5195A的体外活性分析  46-50
    3.4.1 04—5195A对BMP-2基因的作用  46-48
    3.4.2 04-5195A对BMP-2mRNA的调节  48-49
    3.4.3 Western blot检测结果  49
    3.4.4 流式细胞术检测结果  49-50
  3.5 NO.39的体外活性分析  50-53
    3.5.1 NO.39对BMP-2基因的作用  50-52
    3.5.2 NO.39对BMP-2mRNA的调节  52
    3.5.3 流式细胞术检测结果  52-53
  3.6 NO.3的体外活性分析  53-55
  3.7 NO.39及NO.3在动物体内的活性研究  55-64
  3.8 NO.39的药物动力学研究结果  64-68
    3.8.1 方法学评价  64-67
    3.8.2 药物动力学  67-68
  3.9 NO.39的组织分布结果  68-73
    3.9.1 方法学评价  68-71
    3.9.2 组织分布  71-73
4 讨论  73-79
5 结论  79-80
6 参考文献  80-83
7 综述  83-103
8 附图  103-110
致谢  110-111

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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