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用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建及其应用研究

作　者: 仝飞飞
导　师: 吕金印；李莹辉
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物物理学
关键词: 模拟微重力效应成骨细胞分化 Cbfa1 荧光强度 PI3K信号通路
分类号: R85
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

在中长期太空飞行中,空间骨丢失对航天员健康的影响是目前航天医学关注的重点之一。研究表明,微重力条件下,成骨细胞分化功能降低,骨形成减少,特异性转录因子Cbfa1在此过程中起关键作用。研究重力因素对Cbfa1活性调节机制对于阐明空间骨丢失机理非常重要。本研究以未分化的人成骨瘤细胞MG63为对象,利用回转器模拟微重力效应和细胞离心机实现超重,采用基因导入、信号途径干预剂处理等细胞分子生物学技术,研究不同重力因素对成骨细胞分化的影响,探讨重力因素对Cbfa1活性及成骨向分化、以及PI3K信号通路的影响;以期为空间骨丢失机理和对抗防护研究提供科学依据。主要获得以下研究结果:1、合成了以6个Cbfa1结合元件为主要调控元件的miniOC启动子,并构建由该启动子驱动的EGFP报告基因真核表达载体,转染并筛选获得OSE-MG63成骨细胞模型,细胞的荧光强度能够反映Cbfa1的活性,为航天细胞搭载实验提供一种更为方便有效的研究模型。2、模拟微重力环境下培养MG63细胞ERK1/2、p38、p85蛋白表达量均低于对照组(1G),并且随回转时间增加其抑制作用持续,表明微重力影响成骨细胞增殖分化的MAPK、PI3K信号途径。模拟微重力效应显著抑制PI3K的p85蛋白磷酸化水平,并且下调了Cbfa1的表达;相反,超重效应能够提高p85蛋白磷酸化水平,上调了Cbfa1的表达。3、以构建OSE-MG63细胞模型为对象,采用不同重力条件与PI3K信号通路的阻断剂(LY294002)和激活剂(IGF-I)复合处理,结果显示:模拟微重力显著抑制OSE-MG63细胞的荧光强度,而超重则提高其荧光强度;IGF-I能够诱导Cbfa1活性提高,但由IGF-I诱导的荧光强度升高作用受到LY294002的显著抑制。表明模拟微重力减弱IGF-I的成骨作用,超重提高Cbfa1活性是通过PI3K信号通路。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章综述  8-21
  1.1 空间骨丢失现象  8-11
    1.1.1 正常重力下的骨代谢  9
    1.1.2 成骨细胞的分化过程  9-10
    1.1.3 微重力对成骨细胞分化的影响  10-11
  1.2 骨向分化特异性转录因子CBFA1  11-14
    1.2.1 Cbfa1 概况  11-13
    1.2.2 Cbfa1 的功能  13-14
    1.2.3 微重力对Cbfa1 的影响  14
  1.3 信号通路对CBFA1 的表达与活性影响  14-18
    1.3.1 Cbfa1 的表达及活性调节  14-15
    1.3.2 多种信号通路聚焦于Cbfa1  15-16
    1.3.3 P13K-Akt 信号通路在成骨细胞分化中的作用  16-17
    1.3.4 微重力影响P13K-Akt 信号通路  17-18
  1.4 微重力下骨代谢的研究方法  18-19
    1.4.1 微重力模拟方法及其应用  18-19
    1.4.2 实时报告基因——绿色荧光蛋白GFP  19
  1.5 本研究的目的与意义  19-21
第二章构建用荧光强度反映CBFA1 活性的成骨细胞模型  21-34
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 主要仪器  21-22
    2.1.2 试剂及其配制  22-23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 6OSE2 基因启动子扩增  23-24
    2.2.2 p6OSE2-EGFP 表达载体构建  24-26
    2.2.3 MG63 细胞培养、传代的方法  26
    2.2.4 G418 最小致死浓度确定  26
    2.2.5 脂质体法转染MG63 细胞  26-27
    2.2.6 OSE-MG63 稳定转染细胞株的筛选  27
    2.2.7 OSE-EGFP 稳定细胞株荧光强度分析  27
    2.2.8 细胞内碱性磷酸酶ALP 染色方法（改良Gomori 法）  27-28
    2.2.9 细胞培养液碱性磷酸酶ALP 活性测定方法  28
  2.3 结果与分析  28-32
    2.3.1 6OSE2 基因启动子扩增  28-29
    2.3.2 表达载体的鉴定结果  29
    2.3.3 G418 最小致死浓度的确定  29
    2.3.4 稳定转染6OSE2-EGFP 基因细胞株的筛选  29-30
    2.3.5 OSE-MG63 细胞株对骨向诱导剂的响应  30-32
  2.4 讨论  32-34
第三章不同重力条件对CBFA1 活性及信号通路的影响  34-46
  3.1 材料  34-36
    3.1.1 主要仪器  34-35
    3.1.2 主要试剂  35-36
  3.2 方法  36-40
    3.2.1 MG63 细胞在回转模拟微重力下的培养方法  36
    3.2.2 MG63 细胞在超重条件下的培养方法  36-37
    3.2.3 静止条件下加入P13K 激活剂及抑制剂培养MG63 的方法  37
    3.2.4 模拟微重力环境下加入P13K 激活剂培养OSE-MG63 的方法  37
    3.2.5 超重环境下加入P13K 抑制剂培养OSE-MG63 的方法  37-38
    3.2.6 细胞裂解及总蛋白提取  38
    3.2.7 细胞总蛋白浓度测定  38-39
    3.2.8 Western-Blot 检测信号分子蛋白表达  39-40
    3.2.9 OSE-MG63 细胞荧光强度分析方法（如2.3.7）  40
    3.2.10 细胞内ALP 染色方法（如2.3.8）  40
  3.3 结果与分析  40-44
    3.3.1 模拟微重力环境下p38、Erk1/2 和p85 蛋白表达变化  40
    3.3.2 不同重力环境对p85 及Cbfa1 蛋白表达的影响  40-41
    3.3.3 IGF-I 对p85 蛋白表达及磷酸化的影响  41
    3.3.4 模拟微重力环境下P13K 激活剂对Cbfa1 活性及骨向分化的影响  41-42
    3.3.5 超重环境下P13K 抑制剂对Cbfa1 活性及骨向分化的影响  42-44
  3.4 讨论  44-46
结论  46-47
参考文献  47-53
附录  53-56
致谢  56-57
作者简介  57

用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建及其应用研究

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