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人磷酸二酯酶4B2基因的克隆和异源表达研究

作　者: 孙超渊
导　师: 朱平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 医科大学磷酸二酯酶重组蛋白抑制剂协和硕士学位论文转化子异源表达嗜酸性粒细胞酿酒酵母
分类号: R965.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

磷酸二酯酶(PDEs)通过催化cAMP和cGMP水解，调节细胞内第二信使的水平。磷酸二酯酶4特异地水解cAMP，主要存在于中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，T淋巴细胞，巨噬细胞等免疫和炎症细胞中。PDE抑制剂可用于治疗多种疾病，因此极具市场价值。PDE4选择性抑制剂可以用于治疗哮喘，慢性阻塞性肺疾病，抑郁，阿尔茨海默氏症、帕金森氏病等重大疾病。本论文中，克隆并用大肠杆菌和酵母菌表达人磷酸二酯酶4B2。所表达的蛋白将用于建立高通量筛选模型筛选其抑制剂。人白血病单核细胞中加入1ng／ml LPS于37℃孵育3小时后，提取总RNA。以总RNA为模扳，用RT-PCR的方法得到人PDE4B2编码区的基因片段。核苷酸序列分析表明扩增的片段与GenBank报道的序列相差三个碱基。通过定点突变得到了正确的编码序列。将cDNA分别插入表达载体PET-32a，pPIC9K和pYeDP60中，并在大肠杆菌和酵母菌中表达。筛选阳性转化子，诱导表达后得到重组蛋白。Western blot表明所表达的蛋白是重组人PDE482。纯化后，活性测定表明由大肠杆菌表达的蛋白具有类似天然蛋白的生物活性。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-8
英文摘要  8-9
前言  9-12
  1 PDE4s基因和转录  9-10
  2 PDE4s的结构和功能  10
  3 PDE4s在cAMP信号转导途径中的作用和活性调节  10-11
  4 PDE4选择性抑制剂  11-12
第一章人磷酸人磷酸二酯酶4B2基因的克隆  12-31
  1 实验材料  12-13
  2 实验方法  13-25
    2.1 细胞总RNA的提取  13
    2.2 RT-PCR  13-16
    2.3 PCR产物的回收  16
    2.4 DNA片段的克隆  16-17
    2.5 序列的测定和检索分析  17
    2.6 PDE4B2基因的体外定点突变  17-25
  3 结果与讨论  25-31
    3.1 总RNA的提取  25-26
    3.2 cDNA的获得  26-31
第二章人磷酸二酯酶4B2基因的异源表达  31-56
  1 实验材料  31-36
  2 实验方法  36-47
    2.1 PDE4B2在E.coli中的表达  36-41
      2.1.1 表达载体的构建  36-37
      2.1.2 目的质粒的转化  37-38
      2.1.3 PDE4B2重组蛋白的表达  38
      2.1.4 PDE4B2重组蛋白的鉴定  38-39
      2.1.5 PDE4B2重组蛋白的纯化  39-40
      2.1.6 PDE4B2重组蛋白活性的测定  40-41
    2.2 PDE4B2在P.pastoris中的表达  41-45
      2.2.1 表达载体的构建  41-42
      2.2.2 目的质粒的转化  42-45
      2.2.3 PDE4B2重组蛋白的表达  45
      2.2.4 PDE4B2重组蛋白的鉴定  45
      2.2.5 PDE4B2重组蛋白的纯化  45
      2.2.6 PDE4B2重组蛋白活性的测定  45
    2.3 PDE4B2在酿酒酵母WHT中的表达  45-47
      2.3.1 表达载体的构建  45-46
      2.3.2 目的质粒的转化  46-47
  3 结果与讨论  47-56
    3.1 PDE4B2在E.coli中的表达  47-52
    3.2 PDE4B2在Pichia pastoris中的表达  52-55
    3.3 PDE4B2在酿酒酵母WHT中的表达  55-56
全文总结  56-57
参考文献  57-61
综述磷酸二酯酶4研究进展  61-75
致谢  75-76

人磷酸二酯酶4B2基因的克隆和异源表达研究

内容摘要

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