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一人α-synuclein cDNA克隆及异源表达研究二 Chloroperoxidase基因在毕赤酵母系统的表达研究

作　者: 韩杨
导　师: 朱平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 转化子毕赤酵母医科大学硕士学位论文培养基琼脂糖凝胶电泳重组质粒协和发酵液异源表达
分类号: R749.1;R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

α-synuclein主要存在于中枢神经系统的突触前末梢。该蛋白目前已受到国内外学者的普遍关注，主要原因在于发现它的功能异常与几种神经退行性疾病，如帕金森氏病(parkinson’s disease，PD)、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)和老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)有关。α-synuclein的生理功能至今仍不完全清楚。有一些报道显示：α-synuclein与神经细胞膜的稳定性和可塑性有关，并具有抗神经细胞凋亡的作用和分子伴侣样功能，它还参与了信号传导过程。但其他一些报道则表明，它的异常积累和聚集将导致α-synuclein类疾病，如PD的发生，而且这是一个由环境或遗传因素触发的级联(cascade)反应，包括α-synuclein的错误折叠与正常功能的丧失。在高浓度时，α-synuclein(以及它的突变体形式A53T和A30P)有自我聚集的倾向，导致寡聚体初原纤维、原纤维和多聚体的形成。有证据显示两种突变体形成初原纤维的速率高于其野生型蛋白，而A30P形成原纤维的速率较低，A53T形成原纤维的速率较高。α-synuclein的寡聚体(protofibril)被认为具有神经细胞毒性，能引起细胞凋亡。鉴于α-synuclein具有上述病理学特征，且神经细胞内α-synuclein聚集体的形成又是几种神经退行性疾病，如PD的一个特性，α-synuclein有可能被作为一个潜在的靶点用于新型抗PD药物的寻找。本文从人骨髓神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中成功克隆到α-synuclein编码序列并完成A53T点突变，后者将被用于构建PD转基因动物的表达载体。同时在毕赤酵母中成功表达了人α-synuclein的A53T突变蛋白，并初步观察了A53T突变型α-synuclein在酵母细胞内表达对细胞生长的影响。以多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞总RNA为模板，应用RT-PCR方法扩增了人α-synuclein包含编码区的cDNA片段，核苷酸序列分析表明扩增片段与GenBank报道序列完全一致。将目的基因进行定点突变，使Ala53→Thr，将获得的突变基因进行以下研究：1)亚克隆到pcDNA3.0，构建含BGH polyA site的重组质粒，用于进一步构建PD转基因动物重组表达质粒。每一步得到的亚克隆经序列测定与比对，准确无误。2)将α-synuclein A53T编码区序列插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的α-因子信号肽编码基因序列下游，构建重组质粒pPIC9K-Sym；进一步构建含有绿色萤光蛋白(GFP)融合基因的重组质粒pPIC9K-SyGFP。重组质粒用SacⅠ线性化后，采用电击方法转入毕赤酵母感受态(Pichia pastoris GS115)细胞。利用MD培养基和含有G418的YPD培养基筛选出His~+Mut~+转化子。转化子经PCR鉴定后，用BMMYC培养基培养，以终浓度为1％(v／v)的甲醇诱导表达。发酵夜上清经过SDS-PAGE分析，发现转入pPIC9K-SyGFP的转化子在40kDa处有特异蛋白条带，而转入pPIC9K-Sym的转化子在20kDa处有蛋白条带。Western blot实验结果证实表达蛋白为重组人α-synuclein。3)将α-synuclein A53T编码区序列亚克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K上，构建胞内重组表达质粒pPIC3.5K-Sym和pPIC3.5K-SyGFP，用上述方法转化毕赤酵母感受态(Pichia Pastoris GS115)细胞并进行转化子筛选。甲醇诱导表达后，用荧光显微镜观察到含pPIC3.5K-SyGFP的重组菌株产生绿色荧光，根据荧光强度判断，融合蛋白表达量很高，并且主要集中在细胞质。转化子经液体及固体培养和甲醇诱导后，没有见到细胞凋亡现象，生长反而比较旺盛，其原因可能在于转化子尚缺乏一定的环境和遗传方面的条件。鉴于某些基因缺失突变会显著增加酵母对α-synuclein的敏感性(增强α-synuclein毒性)，对GS115／pPIC3.5K-SyGFP转化子进行了紫外诱变处理，获得了一些在MM培养基(碳源：甲醇)上生长受到抑制、而在MD培养基(碳源：葡萄糖)上生长基本正常的突变株(如uv13)，这些突变株在MM培养基上的生长速率也明显低于对照转化子在MM培养基上的生长速率。对此模型进行优化并将其用于高通量筛选将有助于寻找对抗α-synuclein毒性的化合物。海洋真菌Caldariomyces fumago分泌的氯化物过氧化物酶(Chloroperoxidase，CPO；EC 1.11.1.10)，相对分子量42kDa，是一种高度糖基化的单体血红素蛋白，具有广谱的氧化活性。它兼具P450单加氧酶和过氧化物酶的结构特征。除了能进行卤化反应外，对多种底物的氧化具有立体选择性。CPO催化的不对称环氧化可以生成多种化合物，后者可用作精细化工原料或者光学纯的药物中间体。除了烯烃的环氧化，CPO在催化C-H羟化、硫醚氧化和醇的立体选择性氧化及拆分的转换数和收率上也优于很多其它过氧化物酶。但CPO在不对称环氧化的应用上受到底物结构的限制，另外，由于C．fumago最适培养温度为19℃，且生长缓慢，不利于用其进行生物转化反应。通过基因工程手段大量获得重组酶并对酶结构进行定向改造，是解决上述问题的有效途径之一。目前，大量尝试用基因工程方法生产CPO未获真正的成功，确切原因尚不清楚。有学者认为该酶在重组表达时其mRNA不稳定，因而影响到重组蛋白的获得。本文探索用毕赤酵母表达产生CPO的可能性，希望能找到影响重组表达的真正原因，最终实现CPO的高表达。用PCR方法获得了C．fumago的CPO基因，测序结果证明所获基因与GenBank报道的CPO基因序列完全一致。将CPO基因与GFP基因采用不同顺序连接，以融合的GFP作为报告基因，构建了几种不同的毕赤酵母重组表达质粒。后者经SacⅠ线性化后，用电击方法转入毕赤酵母感受态(Pichia Pastoris GS115)细胞。利用MD培养基和G418抗性筛选出His~+Mut~+转化子。经PCR方法鉴定后，转化子用BMMYC培养基培养，以终浓度为1％(v／v)的甲醇诱导表达。发酵液上清用SDS-PAGE分析，发现融合GFP的转化子在30kDa处有特异蛋白条带，与预期的GFP大小基本一致；用荧光分光光度计检测到GS115／pPIC9k-CKG转化子发酵液上清的RFU较高，说明GFP获得表达，但所有形式的转化子均未在发酵液上清检测到CPO活性。鉴于CPO-GFP融合蛋白中，CPO位于GFP的上游，而GFP已得到表达，推测CPO在mRNA水平上比较稳定而在蛋白质水平上不稳定易降解，可望通过DNA改组等方法获得稳定的CPO重组蛋白。

全文目录

符号缩写说明  4-6
第一部分人α-synuclein cDNA克隆及异源表达研究  6-67
  中文摘要  6-8
  英文摘要  8-11
  1 引言  11-13
  2 实验材料与设备  13-17
  3 实验方法  17-36
  4 结果与分析  36-61
  5 讨论  61-63
  6 创新点  63-64
  参考文献  64-67
第二部分 Chloroperoxidase基因在毕赤酵母系统的表达研究  67-99
  中文摘要  67-68
  英文摘要  68-70
  1 引言  70-71
  2 实验材料与设备  71-72
  3 实验方法  72-81
  4 结果与分析  81-93
  5 讨论  93-96
  6 创新点  96-99
综述:PD相关基因α-synuclein的研究进展  99-114
致谢  114-115

一 人α-synuclein cDNA克隆及异源表达研究 二 Chloroperoxidase基因在毕赤酵母系统的表达研究

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