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Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究

作　者: 杜恩岐
导　师: 齐义鹏
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: 杆状病毒 p13基因杀虫活性 Bac to Bac系统 RNA干扰类Leu Zipper 跨膜区蛋白定位分子进化
分类号: S482.3
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

p13基因由我们实验室于1995年首次报道。随着大规模基因组测序的发展,越来越多的杆状病毒全基因组被测定,目前已报道的杆状病毒p13基因多达二十多个。奇怪地是这些p13基因均特异地存在于II型核型多角体病毒和部分颗粒体病毒的基因组中。而I型核型多角体病毒基因组中则不存在。对于p13基因的启动子和编码区的结构功能目前已有预测,但尚无相关研究工作报道。本研究对p13基因的启动子活性、p13基因的进化、在天然系统及异源系统中的功能及其潜在的杀虫活性进行了研究,为p13基因进一步深入研究和杀虫潜力应用的开创之举。目前已有14类不同杆状病毒的22个p13基因序列报道,我们经DNASTAR软件对已报道的14类杆状病毒(每类各选一个序列)P13氨基酸同源性比较发现,不同杆状病毒P13之间的同源性在42.1%-74.7%,其中Ls-P13与HaNPV P13同源性最高(58.7%)与PoGV P13最低(44%)。对P13的氨基酸同源性比较和进化树分析表明P13可被分为两个群,I群为GV的P13,它们之间有高度同源性。II群为II型NPV的P13,它们之间同源性差异较大。其中II群根据同源性又可分为两个亚群:I亚群为LsNPV,HaNPV和SlNPV三种,其他II型NPVs的P13为第II亚群。p13基因5’UTR普遍存在早期启动子核心序列GTGTTATA及CAT/AT盒和晚期启动子核心序列TTAAG盒。在早晚期启动子之间有一3-30aa组成的小ORF,推测这一小顺反子可能具有重要的调控功能。在p13基因5’UTR的上游,有一个杆状病毒普遍存在的同源重复序列(Homologue repeat,简称hr),一般hr有多个,而p13基因的hr的数目因病毒种类的不同而不同。已经证明,杆状病毒的hr是DNA复制的ori和转录激活的增强子,对早期基因的表达有增强作用。因此由p13基因的5’UTR结构,我们推测p13基因为一早晚期基因,并主要在早期发挥作用。以Ha-p13为例,我们证明p13基因启动子从2h.p.i到90h.p.i均有活性。不管在天然Hz-AM1细胞还是在异源Sf9细胞中,Ha-p13基因启动子本身并不是一个强启动子,但在hr4存在时,Ha-p13基因启动子活性在Hz-AM1细胞中提高了20倍,在Sf9细胞中则提高了2000倍。携带hr4增强子的Ha-p13基因启动子活性在天然细胞和异源细胞中存在的巨大差异可能受细胞的某些因子调控。为研究P13蛋白功能,我们以Ha-P13和Ls-P13为例,分别对P13蛋白在天然和非天然宿主昆虫细胞和幼虫中的作用进行了研究。由于携带eGFP的棉铃虫杆状病毒HaSNPV-G本身带有Ha-p13基因,因此我们通过dsRNA-Hap13来沉默Ha-P13的表达。流式细胞仪检测结果发现5μg dsRNA-Hap13可以有效地抑制Ha-P13在Sf9和Hz-AM1细胞中的表达。HaSNPV-G与5μg dsRNA-Hap13共感染发现棉铃虫的死亡率明显下降,而且与dsRNA-Hap13的使用剂量成正相关性。这表明p13在天然系统中是一个杀虫相关基因。另一方面,由于I型核型多角体病毒如AcMNPV中缺少p13基因,因此我们将Ls-p13基因插入AcMNPV基因组构建重组病毒rAc-hr5/IE1-Lsp13-G来检验异源系统中P13的杀虫活性。生物测定实验进一步证明,Ls-P13能够明显提早AcMNPV的杀虫时间。通过杆状病毒Ls-P13或Ha-P13与不携带Ls-p13的AcMNPV共同注射感染幼虫发现,一旦Ls-P13的亮氨酸拉链结构发生突变,Ls-P13的杀虫活性也会随之失去,尽管我们对这种确切机理还没有完全解释清楚,但是P13提早杀虫时间的特性很可能使其成为未来新型生物杀虫剂的侯选基因。为进一步研究P13在异源系统中提早杀虫的机理,我们构建了一系列重组病毒来研究P13对病毒在细胞中增殖的影响。我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显抑制多角体的产生,其抑制效率随P13表达时相的提前而加强,即P13的早期表达有更强的抑制作用。当P13的亮氨酸拉链发生突变时,P13对多角体的抑制效率随之丧失。而P13的跨膜区发生缺失时,对多角体的效应与Leu Zipper相反,即抑制效果明显提高。另一方面,P13对出芽病毒(BV)的效应与对多角体的效应不同,我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显增加出芽病毒(BV)的产生,当亮氨酸拉链突变时,P13对BV的增殖效率随之丧失;当P13的跨膜区发生缺失时,P13对BV的增殖略有下降。以上结果充分证明P13提前杀虫效果的机制是由于P13改变了BV和多角体之间的动态平衡,主要是由于P13的LZLD(Leucine zipper like domain)减少了多角体产量,增加了BV产量。跨膜区使P13晚期定位在质膜上,与LZLD效果相反的是,当TM缺失后P13的定位向核中转移,对多角体的抑制进一步加强,而对BV增加略有下降。BV的参加则加速了AcMNPV从细胞到细胞的次级感染,所以使注射感染时间大大提早。此外,我们对Ha-P13在天然Hz-AM1细胞和Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位进行了研究。得出了一致的结果,我们发现P13不管在天然细胞还是异源细胞中,转染48h后主要定位在细胞质膜上。Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位为一动态过程,即早期(12h)定位于细胞核中,随后(24h)从细胞核向细胞质膜移动,最后定位于细胞质膜上。当Ls-P13的I、II跨膜区依次缺失时,Ls-P13的晚期定位逐渐从细胞质膜向细胞核移动。尤其在跨膜区II发生缺失时,绝大部分P13蛋白已脱离了细胞质膜而进入核中。由于多角体在核中装配而BV主要在细胞质膜上装配,而且Ls-P13具有抑制多角体产生和促进BV生成的作用。因此当跨膜区缺失时,Ls-P13的定位从细胞质膜而向核移动,核中的Ls-P13的增加和细胞质膜上Ls-P13的降低很好地解释了为什么在跨膜区缺失后L s-P13对多角体的产生的抑制效果进一步加强而对BV的增强效果稍有下降。另一方面,由于L s-P13早期主要在核中表达,随后从核中向细胞质膜上移动,这也很好地解释了为什么L s-P13对多角体的抑制效果随表达时相的推迟而减弱。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-14
第一章杆状病毒相关研究进展  14-57
  （一）杆状病毒的分子生物学  14-35
  （二）杆状病毒的表达系统  35-46
  （三）杆状病毒杀虫剂  46-51
  （四）粘虫杆状病毒基因组研究  51-57
第二章杆状病毒Ⅱ型NPV p13 基因的启动子活性和分子进化  57-71
  摘要  57
  2.1 引言  57-59
  2.2 材料与方法  59-62
  2.3 结果  62-70
  2.4 讨论  70-71
第三章杆状病毒Ⅱ型NPV p13 基因是一个杀虫相关基因  71-84
  摘要  71
  3.1 引言  71-72
  3.2 材料与方法  72-77
  3.3 结果  77-83
  3.4 讨论  83-84
第四章 LsNPV P13 蛋白对AcMNPV 多角体和BV 产量的影响  84-99
  摘要  84
  4.1 引言  84-85
  4.2 材料和方法  85-90
  4.3 结果  90-97
  4.4 讨论  97-99
第五章 P13 蛋白在细胞中的定位  99-109
  摘要  99
  5.1 引言  99
  5.2 材料与方法  99-103
  5.3 结果  103-107
  5.4 讨论  107-109
研究总结  109-110
创新点  110-111
参考文献  111-153
发表及待发表文章  153-154
致谢  154

Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究

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