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CK2磷酸化TNFAIP1并影响其生物功能

作　者: 杨利平
导　师: 张健；周建林
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学及分子生物学
关键词: 肿瘤坏死因子α TNFAIP1 酪蛋白激酶2 核因子-κB 磷酸化
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

TNFAIP1是一个受肿瘤坏死因子α诱导的蛋白。它能和PCNA以及DNA聚合酶δ的小亚基p50同时相互作用，并且在PCNA存在的条件下激活DNA聚合酶δ的活性。这表明该基因可能在TNFα信号通路以及DNA合成和DNA修复中发挥作用。前人实验证明TNFAIP1可能在老年痴呆症的发展和肝脏损伤后的修复过程中起重要的保护作用。核转录因子-κB (NF-κB)是TNFα信号通路中的一种重要的转录因子，在TNFα诱导的免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种过程中发挥重要的作用。蛋白激酶CK2是一种在真核细胞中普遍存在的高度保守的信使非依赖性丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，目前为止已经发现CK2的磷酸化靶蛋白有300多种，其磷酸化靶蛋白的Ser／Thr氨基酸残基，并且它的一致序列是(Ser／Thr)-X-X-(Asp／Glu)。该文克隆了TNFAIP1的基因并在原核和真核表达系统中表达了TNFAIP1蛋白。通过实时定量PCR实验检测TNFAIP1在常见细胞系中的mRNA水平，发现在COS7和NIH3T3两种细胞系中的表达量非常高，而在HeLa、MCF7、PanC1、SW480、HepG2、A549等几种癌细胞系中的表达量较低，推测TNAIP1在癌症的发生中可能起到重要的作用。通过体外和体内的相互作用证明了TNFAIP1确实能和CK2β亚基相互作用，并运用体外磷酸化实验证明CK2能在Ser278、Ser280磷酸化TNFAIP1。通过荧光素酶活性分析，TNFAIP1磷酸化后对NF-κB转录活性的抑制作用增强。TNFAIP1磷酸化后对NF-κB转录活性的抑制作用增强可能是通过影响TNFA1P1蛋白的稳定性实现的。

全文目录

英文缩写表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-21
第一部分材料与方法  21-46
  1 材料  21-27
    1.1 主要仪器设备  21-22
    1.2 菌种和细胞株  22
    1.3 载体和工具酶  22-23
    1.4 抗体  23
    1.5 试剂盒  23
    1.6 其它试剂  23-24
    1.7 所需溶液  24-27
  2 方法  27-46
    2.1 表达载体的构建  27-31
    2.2 融合蛋白质的表达  31-35
    2.3 细胞培养  35-37
    2.4 TNFAIP1与CK2β之间的相互作用分析  37-38
    2.5 荧光活性分析  38-40
    2.6 磷酸化分析  40-43
    2.7 荧光实时定量PCR  43-44
    2.8 蛋白质降解实验  44-46
第二部分结果与分析  46-56
  1 表达载体的构建  46-47
    1.1 细胞总RNA的提取  46
    1.2 人的TNFAIP1基因的克隆  46-47
  2 Western-blot证明融合蛋白质在原核细胞中表达  47-48
  3 Western-blot证明融合蛋白质在真核细胞中表达  48
  4 TNFAIP1在几种常见细胞系的内源表达差异  48-49
  5 GST pull-down证明TNFAIP1和CK2β在体外直接相互作用  49-50
  6 免疫共沉淀证明TNFAIP1和CK2β在HaLa细胞中相互作用  50
  7 TNFAIP1被CK2磷酸化的位点分析  50-53
  8 TNFAIP1磷酸化后对NF-KB和AP1转录活性的抑制作用的影响  53-54
  9 TNFAIP1磷酸化后其蛋白的稳定性的改变  54-56
第三部分讨论  56-61
参考文献  61-67
致谢  67-68
附录Ⅰ  68-69
附录Ⅱ  69

CK2磷酸化TNFAIP1并影响其生物功能

内容摘要

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