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7-氨基头孢烷酸酶法生产的研究

作　者: 郑华宝
导　师: 赵宇华；杨晟
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: D-氨基酸氧化酶 戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶 毕赤酵母 固定化酶 血红蛋白 组氨酸标签 亲和纯化
分类号: Q814.9
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 312次
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内容摘要


D-氨基酸氧化酶（D-Amino Acid Oxidase，DAAO）和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶（Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GLA）是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸的重要工业用酶，头孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）经DAAO催化氧化脱羧反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸（GL-7-ACA），再在GLA作用下，水解生成7-氨基头孢烷酸（7-ACA）。本学位论文围绕两酶法生产7-ACA进行了以下方面的研究。1．以携带6个组氨酸（6*His）的DAAO（HDAAO）编码序列构建三株整合型巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）基因工程菌。在三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（GAP）控制下胞内表达HDAAO的MMZY03，以及醇氧化酶启动子（Alcohol Oxidase，AOX1）启动子控制下分泌表达菌株MMZY02和胞内表达菌株MMZY01。诱导型重组菌株发酵培养基选用基本盐培养基，组成型重组菌株发酵培养基选用YPD培养基。三种重组菌株在5L自控罐的发酵实验显示，MMZY03发酵13h的产酶达到7293 U/L。而据报道的AOX1控制下表达量达到最高需要43h。然而不论是AOX1的诱导分泌型表达（MMZY01），还是GAP启动子的组成型分泌表达（MMWY01）产酶活力均不高，并不能满足实际应用的需要。2．组成型胞内表达HDAAO的重组P.pastoris MMZY03发酵后收获的含DAAO细胞经过压榨破壁，无细胞提取液经二价金属螯合亲和层析纯化，进一步以AmberzymeTM环氧版树脂为载体，制得的HDAAO固定化酶活力为75U/g（湿载体）。该固定化酶连续用于CPC的酶促转化反应14批次，HDAAO的表观活力并无明显下降。因此，所构建的组成型胞内表达HDAAO的重组P.pastorisMMZY03以及HDAAO固定化酶制备工艺具有潜在的产业化应用前景。3．D-氨基酸氧化酶属于黄素蛋白酶。增加酶反应系统的内部气压或通入纯氧气来提高反应液中的溶解氧浓度将有助于提高DAAO催化效率。据报道，在氧气缺乏的环境下，来源于透明颤菌的血红蛋白（VHb）能提高异源宿主细胞的生长量。红酵母来源（Rodotorula gracilis）的DAAO与VHb融合表达，融合蛋白制备的固定化酶提高了对CPC的转化效率。我们推测在体外VHb能起到氧载体作用。本工作分别构建了表达VHb，三角酵母DAAO和VHb融合表达的蛋白。分别添加1.0 mg游离态VHb或300 mg固定化VHb，固定化D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素C的比活力与对照相比分别提高了3倍和2倍。将三角酵母DAAO和VHb融合表达，制备的固定化酶活力要高于没有融合的DAAO。4．在GL-7-ACA酰化酶的一步纯化并固定化的研究中，构建了酰化酶N端组氨酸标签位置和长度均不等的四种重组质粒，即pET28GA01，pET28GA02，pET24GA01，pET24GA02。这些重组质粒在E.coli BL21（DE3），宿主细胞中发酵表达，证明BL21（DE3）/pET28GA01的发酵单位最高，达到3800 U/L。BL21（DE3）/pET28GA02发酵单位是2184 U/L。BL21（DE3）/pET24GA01和BL21（DE3）/pET24GA02发酵单位分别是2092U/L和754U/L。经对固定化载体的优选确定以FP-IDA-Ni2+树脂分别对等量的4种GLA进行一步纯化，固定化结果表明固定化酶表观活力在66.7到80 U/g之间，差别不大，其中以28GA01催化剂转化反应21批次，7-ACA转化收率约是90％，未发现GLA活力下降。本学位论文研究初步结果为D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶在两步酶法制备7-ACA中实际应用提供了基本数据。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章 绪论  13-37
  1.1 酶法生产7-氨基头孢烷酸  13-29
    1.1.1 D-氨基酸氧化酶  13-15
    1.1.2 DAAO来源和生物学作用  15
    1.1.3 DAAO基本性质  15-16
    1.1.4 DAAO底物特异性  16
    1.1.5 DAAO热稳定性和pH稳定性  16-17
    1.1.6 DAAO基因克隆和表达  17-19
    1.1.7 DAAO蛋白质结构研究  19-23
    1.1.8 DAAO产业化应用  23-24
    1.1.9 头孢菌素酰化酶  24-29
  1.2 酶法转化CPC生成7-ACA  29-30
  1.3 展望  30-37
第2章 三角酵母D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中表达纯化及固定化  37-55
  2.1 前言  37-38
  2.2 材料与方法  38-47
    2.2.1 菌种、质粒、工具酶和化学试剂  38
    2.2.2 配置培养基  38-40
    2.2.3 整合载体构建  40
    2.2.4 重组质粒转化与筛选  40-41
    2.2.5 DAAO高表达转化子筛选  41-43
    2.2.6 四种重组毕赤酵母菌株发酵  43-44
    2.2.7 酶活力测定  44-45
    2.2.8 蛋白浓度测定  45
    2.2.9 亲和载体制备方法  45-46
    2.2.10 重组HDAAO纯化和固定化  46
    2.2.11 头孢菌素C转化反应  46-47
  2.3 结果  47-51
    2.3.1 重组菌株筛选  47
    2.3.2 重组菌株在5L发酵罐中培养  47-50
    2.3.3 HDAAO纯化和固定化  50
    2.3.4 固定化HDAAO转化CPC  50-51
  2.4 讨论  51-55
第3章 透明颤菌血红蛋白增强D-氨基酸氧化酶催化活性  55-76
  3.1 前言  55-60
    3.1.1 VHb的结构及特性  55-56
    3.1.2 VHb基因克隆、表达与调控  56-58
    3.1.3 VHb的生理功能  58-60
  3.2 材料与方法  60-65
    3.2.1 工具酶和化学试剂  60
    3.2.2 重组质粒和菌株构建  60-62
    3.2.3 基因工程菌发酵  62-63
    3.2.4 DAAO活力测定  63
    3.2.5 过氧化氢酶活力测定  63-64
    3.2.6 酯酶活力测定方法  64
    3.2.7 蛋白质浓度测定方法  64
    3.2.8 亲和纯化  64-65
    3.2.9 固定化酶制备和CPC转化  65
  3.3 结果  65-71
    3.3.1 溶氧对VHb,HDAAO和HVDAAO重组蛋白表达的影响  65-66
    3.3.2 固定化VHb,HDAAO和HVDAAO  66-68
    3.3.3 VHb提高HDAAO对CPC的催化效率  68-70
    3.3.4 HDAAO和融合蛋白HVDAAO的固定化酶活力比较  70-71
  3.4 讨论  71-76
第4章 一步纯化固定化GL-7-ACA酰化酶  76-93
  4.1 前言  76-77
  4.2 实验材料与方法  77-84
    4.2.1 质粒,菌株,工具酶和试剂  77-78
    4.2.2 酰化酶重组质粒构建  78-79
    4.2.3 培养基  79
    4.2.4 重组菌株发酵  79-80
    4.2.5 GLA粗酶液提取  80
    4.2.6 FP-IDA-Ni2+载体制备  80-82
    4.2.7 GLA固定化和纯化  82
    4.2.8 比色法测定GLA活力  82-83
    4.2.9 HPLC测定GLA活力  83
    4.2.10 蛋白质浓度测定  83
    4.2.11 pH、温度和H2O2对固定化GLA稳定性影响  83-84
  4.3 结果  84-89
    4.3.1 四种GLA表达菌株构建  84
    4.3.2 GLA重组表达  84-85
    4.3.3 GLA固定化  85-86
    4.3.4 GLA的单步纯化  86
    4.3.5 温度、pH和过氧化氢对固定化酶稳定性影响  86-89
    4.3.6 固定化GLA连续转化  89
  4.4 讨论  89-93
第5章 重组DAAO和GLA的表达和固定化  93-104
  5.1 前言  93-94
  5.2 材料与方法  94-96
    5.2.1 固定化酶载体和缓冲液  94-95
    5.2.2 TvDAAO纯化  95
    5.2.3 GLA纯化  95
    5.2.4 TvDAAO固定化方法  95-96
  5.3 结果与讨论  96-104
    5.3.1 重组菌株表达TvDAAO  96-97
    5.3.2 固定化TvDAAO连续转化  97-98
    5.3.3 构建重组菌株pETRD/BL21(DE3)和pVRD/BL21(DE3)  98-99
    5.3.4 重组RgDAAO和VRDAAO表达纯化  99-101
    5.3.5 固定化VRDAAO连续转化  101-102
    5.3.6 固定化GLA连续转化  102-104
论文总结  104-109
  论文研究结论  105-106
    结论一  105
    结论二  105
    结论三  105-106
  论文创新点与不足之处  106
    创新点一  106
    创新点一  106
    论文不足之处  106
  论文后续工作和展望  106-109
    展望  107-109
博士研究生期间己发表和待发表的论文及专利  109-110
致谢  110

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程 > 酶的应用
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