学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻ω-3脂肪酸脱氢酶的基因克隆和功能研究

作　者: 王敬文
导　师: 沈大棱
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 脂肪酸原位杂交 Osfad8 水稻 ω-3脂肪酸脱氢酶转基因烟草类黄酮-3’5’-羟化酶同源摸拟分子对接蝴蝶兰
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 359次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

1水稻是我国最主要的粮食作物之一，水稻的播种主要分布于热带和亚热带地区，其地理分布主要受温度的影响。不饱和脂肪酸是植物膜系统的重要组份之一，它的含量的变化是植物缓解外界温度压力的一种重要手段。本论文中用RT-PCR的方法从水稻Oryza sativa L．中克隆到编码水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶的开放读框，命名为Osfad8。Southern杂交显示水稻中的Osfad8基因至少有两个拷贝，或者是由紧密连锁的一个小的基因家族组成。RT-PCR和原位杂交显示，Osfad8主要在叶中转录，而在根中几乎检测不到任何mRNA的积累。较低温度下(15-20℃)Osfad8的转录水平较常温(25℃)明显增高。原位杂交显示当水稻在15℃下低温处理5天和10天后，在叶片栅栏组织和海绵组织中的能检测到较明显的Osfad8的转录信号。为了进一步研究此基因的功能，我们分别正向和反向将Osfad8的ORF转入烟草中，产生8S-52和8S-101两个正向的转化品系，以及8A-35反向转化品系。在正向转化品系中，Osfad8的ORF以正向插入到CaMV 35S启动子的下游，导致16：3和18：3三烯酸的含量显著增高。低温2℃处理7天发现，对照烟草(pBI 121空载转化植株)的叶片已经明显受到伤害，并且已经萎缩，而在8S-52和8S-101中并没有明显的叶片损伤。在8A-35中，三烯脂肪酸的含量较对照相比降低约40.2％，44℃高温处理3天后，对照植株已经枯萎死亡，而8A-35仍能正常存活。以上数据显示Osfad8为编码低温诱导型的叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶。2蝴蝶兰又名蝶兰，原产亚洲热带和澳大利亚，为热带兰中之珍品被益为热带兰皇后。类黄酮-3’5’-羟化酶(F3’5’H)是合成3’，5’-带羟基的花色素(例如翠雀素)的关健酶，此色素是蓝花和紫花色素形成的前体。本研究从蝴蝶兰花瓣中克隆到了类黄酮-3’5’-羟化酶的cDNA，命名为Phf35h，序列号为DQ148458 in GenBank／EMBL／DDBJ。Phf35h的DNA克隆是通过基于PCR的一系列方法获得的。对Phf35h进行序列分析表明，该基因的DNA序列含有一个内含子，两个外显子，含有一个编码507个氨基酸残基的开放读框。Southern杂交表明在蝴蝶兰中只存在一个拷贝的f35h基因。通过RT-PCR的方法发现Phf35h的mRNA是在花朵发育的中期开始转录，和花青素的积累保持一致；在紫色花瓣中有较高的mRNA的积累，在根中和叶中没有检测到转录。同源模拟PhF3’5’H蛋白的三维结构表明此蛋白主要含有两个结构域：α结构域(含有大量的α螺旋和三个小的β折叠)和β结构域(含有很多β折叠和三个α螺旋)。PhF3’5’H蛋白与底物二氢黄酮醇dihydrokaempferol的结合位点通过分子对接的手法进行分析表明，在此蛋白中存在这一个高度保守的HPPTPLSLPH氨基酸序列，可能和二氢黄酮醇的芳香环相互作用。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
第一章水稻ω-3脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展  10-30
  1 脂肪酸脱氢酶分类与生物学功能  10-17
    1.1 脂肪酸脱氢酶的种类和分布  10-15
    1.2 脂肪酸脱氢酶序列分析  15-16
    1.3 脂肪酸脱氢酶的生物学作用  16-17
  2 编码ω-3脂肪酸脱氢酶的三个基因  17-19
  3 植物脂肪酸的生理功能  19-21
    3.1 脂肪酸与温度耐受性  20-21
    3.2 脂肪酸与植物抗病  21
    3.3 植物脂肪酸的食用及工业价值  21
  4.水稻中ω-3脂肪酸脱氢酶的研究现状  21-23
  参考文献  23-29
  研究思路和技术路线  29-30
第二章温度依赖型的水稻Osfad8基因的克隆和功能分析  30-64
  1.1 前言  30
  2.材料  30-31
    2.1 植物材料  30-31
    2.2 细菌载体与主要试剂  31
    2.3 主要的仪器设备  31
  3 方法  31-48
    3.1 水稻ω-3脂肪酸脱氢酶Osfad8ORF的克隆  31-35
    3.2 Southern杂交  35-38
    3.3 RT-PCR  38-39
    3.4 原位杂交  39-44
    3.5 Osfad8 ORF的载体构建  44-45
    3.6 农杆菌介导的烟草的转化  45-46
    3.7 转基因烟草的鉴定  46-48
  4 结果和讨论  48-59
    4.1 水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因ORF的克隆和序列分析  48-51
    4.2 Southern杂交分析  51-52
    4.3 水稻ω-3脂肪酸脱氢酶不同温度下的时空表达模式  52-53
    4.4 转基因烟草的鉴定  53-57
    4.5 转基因烟草对不同温度的耐受性  57-59
  5 小结  59-61
  参考文献  61-64
第三章蝴蝶兰类黄酮-3’5’-羟化酶基因cDNA的克隆,表达分析和同源建模  64-86
  1.前言  64-66
  2.材料  66-78
    2.1 植物材料  66
    2.2 细菌载体与主要试剂  66-67
    2.3 蝴蝶兰DNA和RNA的提取  67-68
    2.4 蝴蝶兰F35H基因组克隆和cDNA克隆的分离  68-72
    2.5 蝴蝶兰F35H基因的Southern杂交  72-75
    2.6 RT-PCR检测蝴蝶兰F35H基因的表达模式  75-76
    2.7 蝴蝶兰PhF3’5’H三维模型的建立  76
    2.8 PhF3’5’H与底物的分子对接  76-78
  3.结果与讨论  78-86
    3.1 F35H DNA和cDNA克隆的获得  78-81
    3.2 RT-PCR研究蝴蝶兰Phf35h基因的表达模式  81-82
    3.3 三维模型的构建及Phalaenopis F3’5’H蛋白与底物相互作用的研究  82-86
参考文献  86-88
发表的论文  88-89
申请专利  89-90
致谢  90-91

水稻ω-3脂肪酸脱氢酶的基因克隆和功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文