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ω-3脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究

作　者: 陈晓瑛
导　师: 谢之景；苗向阳；王建民
学　校: 山东农业大学
专　业: 临床兽医
关键词: ω-3脂肪酸脱氢酶 ω-3多不饱和脂肪酸基因合成脂肪酸分析转基因技术
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是细胞膜的重要组成成分,在机体的激素代谢和多种酶活性的调控中起着重要功能,一旦缺乏会引起机体生理失调而导致多种疾病,其中最具生物学功能的是ω- 3PUFAs和ω- 6 PUFAs。研究发现ω-6 PUFAs对人体意义不大,其过量的摄入反而会危害人体健康。而ω-3 PUFAs对人体却有积极的意义,已被证实在预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病方面发挥着重要作用。由于哺乳动物及人类不能在体内合成ω-3 PUFAs与ω-6PUFAs,因此必须从食物中摄取来满足需要。由于自然界中ω-6 PUFAs含量丰富而ω-3 PUFAs含量极少,导致人体中ω-6 PUFAs摄入过多而ω-3 PUFAs摄入严重不足,使人体中ω-6/ω-3之比高达16以上。而根据相关的研究,ω-6和ω-3 PUFAs的比例应该在1为适宜,所以人体通常处于ω-3 PUFAs供应不足的状态。哺乳动物体内维持一定量的ω-3 PUFAs可以起到预防心血管疾病、神经退行性疾病甚至癌症的作用,ω- 6与ω-3PUFA的平衡对机体正常生长和内环境的稳定有重要作用,如何增加人体ω-3 PUFAs的摄入量就成了合理利用脂肪酸的关键。ω-3脂肪酸去饱和酶基因是ω-3 PUFAs合成的关键基因,它利用ω-6 PUFAs为底物,在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键,从而合成相应的ω-3 PUFAs。Fat-1基因广泛存在于真菌、植物和一些低等动物中,它可以通过产生出ω-3脂肪酸脱氢酶将多不饱和脂肪酸从ω-6转化为ω-3形式而发挥功能。研究人员已经在转基因动物,如:小鼠、猪等,表达了Fat-1基因,这些研究为探索ω-3 PUFAs功能提供了高效、准确的医学、营养学动物模型。本研究采用分子生物学等技术手段,研究线虫ω-3脂肪酸脱氢酶基因。根据Genbank中报道的线虫Caenorhabditis Briggsae的ω-3脂肪酸脱氢酶sFat-1基因序列,对其密码子进行优化,同时在sFat-1基因的上游引入增强子SP163序列,命名为SP163-sFat-1。人工合成SP163-sFat-1,然后进行克隆、测序,结果序列正确。采用分子生物学技术,将SP163-sFat-1基因克隆在真核表达载体pcDNA3.1的CMV启动子的下游,构建了sFat-1基因的真核表达载体pCDNA3.1(+)-sFat-SP163。采用脂质体介导法,将pCDNA3.1(+)-sFat-SP163转染CHO细胞,同时用pCDNA3.1(+)作为对照。分别用G418对转染的CHO细胞进行抗性筛选,获得了相应的稳定混合细胞系,阳性率达90%以上。将pCDNA3.1(+)-sFat-SP163转染的细胞系命名为sFat-1-CHO,将pCDNA3.1(+)转染的细胞命名为pCDNA3.1-CHO。分别采用荧光定量RT-PCR方法和Western-blot方法,对sFat-1-CHO与pCDNA3.1-CHO进行检测,结果目的基因进行了转录,比pCDNA3.1-CHO高10~5以上;同时目的基因进行了表达,sFat-1-CHO成功表达了sFat-1蛋白,采用气相色谱法,对sFat-1-CHO pCDNA3.1-CHO进行脂肪酸分析,结果sFat-1-CHO中ω-3 PUFAs的含量比pCDNA3.1-CHO高,且ω-6/ω-3的比例下降,表明sFat-1-CHO表达的目的蛋白具有生物学活性。该研究为进一步利用转基因技术促进动物自合成多不饱和脂肪酸的保健性食品提供了试验数据。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-31
  1.1 ω- 3 不饱和脂肪酸的功能及研究进展  12-22
    1.1.1 多不饱和脂肪酸的概述  12-19
    1.1.2 ω-3PUFAs 的作用  19-21
    1.1.3 ω-6/ω-3 PUFAs 的比率  21-22
  1.2 ω- 3 脂肪酸脱氢酶的研究  22-27
    1.2.1 脂肪酸脱氢酶的概述  22-23
    1.2.2 脂肪酸脱氢酶的分类  23-24
    1.2.3 线虫ω-3 多不饱和脂肪酸脱氢酶的研究  24-27
  1.3 精子介导法转基因动物研究进展  27-31
    1.3.1 精子介导法转基因分子机制  27
    1.3.2 精子介导的转基因方法介绍  27-31
2 材料与方法  31-42
  2.1 材料  31-33
    2.1.1 细胞株、表达载体和感受态细胞  31
    2.1.2 主要仪器设备  31
    2.1.3 主要试剂及配制  31-33
  2.2 试验方法  33-42
    2.2.1 基因的合成与克隆测序  33
    2.2.2 真核表达载体的构建  33-34
    2.2.3 转染CHO 细胞及检测  34-42
3 试验结果和数据  42-53
  3.1 基因的合成与克隆测序分析  42-43
    3.1.1 双酶切鉴定结果  42-43
    3.1.2 克隆测序结果  43
  3.2 转染CHO 细胞及检测  43-53
    3.2.1 总RNA 的完整性及纯度检测  43-44
    3.2.2 熔解和扩增曲线分析  44-46
    3.2.3 瞬转细胞Q-PCR 方法检测目的基因  46-47
    3.2.4 G418 筛选浓度  47
    3.2.5 稳转细胞Q-PCR 方法检测目的基因表达效果  47-48
    3.2.6 稳转细胞脂肪酸分析结果  48-50
    3.2.7 Western blot 检测结果  50-53
4 讨论  53-56
5 结论  56-57
6 参考文献  57-67
7 附录  67-70
8 致谢  70-71
9 攻读学位期间论文发表情况  71-72
硕士学位论文内容简介及自评  72

ω-3脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究

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