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NRG-1诱导ErbB异源二聚体间反式磷酸化及其对下游信号通路调控的研究

作　者: 李照民
导　师: 梅岩艾；周明东
学　校: 复旦大学
专　业: 神经生物学
关键词: 磷酸化作用 同源二聚体 复旦大学 信号通路 博士学位 毕业论文 磷酸化反应 酪氨酸残基 共转染 激酶活性
分类号: Q26
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


ErbB受体属于受体型酪氨酸激酶超家族中的Ⅰ亚族，即EGFR家族。这个家族有4个成员，即ErbB1／EGFR、ErbB2／neu、ErbB3、ErbB4。其中ErbB2不能与配体结合，但可与ErbB3或者ErbB4形成异源二聚体。ErbB3的激酶活性有缺失，同源二聚体不能介导信号转导。NRG-1是ErbB3或ErbB4的配体，与ErbB3或ErbB4结合后更易与ErbB2形成异源二聚体。NRG-1与ErbB3或ErbB4有很高的亲和力(＜100nM)，与ErbB2／ErbB3或ErbB2／ErbB4异源二聚体的亲和力更高(＜1nM)。基因修饰小鼠的研究表明ErbB受体及配体在发育过程中扮演着重要的作用。其中ErbB3或者ErbB4基因修饰小鼠的组织器官异常与NRG-1或者ErbB2基因敲除小鼠的异常有相似或者重叠的现象。这表明在体内ErbB2参与NRG-1激活ErbB3或者ErbB4信号通路的过程。本文利用NIH3T3细胞瞬时表达外源ErbB受体的方法研究ErbB受体二聚体间磷酸化发生方式。ErbB2与ErbB3共转染的细胞中NRG-1可以上调ErbB受体的磷酸化水平，这种上调与更多的ErbB2／ErbB3异源二聚体形成有关。NRG-1刺激共转染ErbB2和ErbB3-676(缺少ErbB3胞内段)的细胞中导致异源二聚体增加，而ErbB2的磷酸化水平下降。这表明ErbB3的羧基端，而不是ErbB2的羧基端与ErbB受体二聚体的磷酸化水平上调直接相关。将ErbB2和ErbB3完全分离后免疫印记实验表明ErbB3的磷酸化水平在NRG-1刺激后显著性上调(根据三次独立实验结果)，而ErbB2的磷酸化水平没有明显的变化。这表明ErbB2／ErbB3异源二聚体中只发生了反式磷酸化作用，即NRG-1诱导二聚体中ErbB2的激酶活性将ErbB3的羧基端的酪氨酸磷酸化，而没有将其自身的羧基端酪氨酸残基磷酸化。在乳腺癌细胞BT474和SKBR3中NRG-1刺激后也有ErbB2磷酸化水平下调，而ErbB3磷酸化水平上调的现象。在共转染ErbB2、ErbB4的细胞中NRG-1可上调ErbB2、ErbB4的磷酸化水平，且ErbB2磷酸化水平的上调与更多ErbB2／ErbB4异源二聚体的形成有关。这也支持ErbB2／ErbB4异源二聚体间发生了反式磷酸化，也就是说与ErbB2／ErbB3相比，ErbB4的激酶活性将ErbB2／ErbB4异源二聚体中ErbB2羧基端酪氨酸残基磷酸化。所有数据均证明ErbB异源二聚体间只发生了反式磷酸化反应。连续10天尾静脉注射rhNRG(10ug／kg)后，冠状动脉前降支结扎导致部分心肌梗死(MI)大鼠的心脏泵功能有显著增强。rhNRG迅速激活了大鼠左心室中的ErbB4受体。通过ErbB受体，rhNRG可以快速激活三个重要的信号蛋白Erk1／2和Akt。对Erk1／2的磷酸化水平的调控是持续的，而对Akt的磷酸化水平调控是瞬时的，并出现抑制的现象。尾静脉注射MEK1／2的抑制剂U0126可极其显著性抑制Erk1／2的基础磷酸化水平以及rhNRG对Erk1／2的激活作用。动物试验表明，U0126对于MI大鼠的心脏泵功能没有显著的作用。P13K的抑制剂Wortmannin(简写WM)可显著性抑制Akt的基础磷酸化水平以及rhNRG对Akt的激活作用，而溶剂DMSO也可显著性上调Akt的磷酸化水平，并且与rhNRG上调有叠加效应。动物试验表明WM对MI大鼠的心脏泵功能有显著的促进作用。进一步的研究发现WM抑制Akt的基础磷酸化水平和rhNRG的上调作用的同时，也可以抑制Erk1／2基础磷酸化水平和rhNRG对Erk1／2的上调作用。而U0126对Akt的基础磷酸化水平和rhNRG调控作用没有显著性影响。这证明PI3K是Erk1／2的上游信号分子，也就是说PI3K与MAPK信号通路在大鼠心脏中有Cross—Talk现象。综上所述，我们认为rhNRG对MI大鼠的心脏泵功能的促进作用是通过PI3K的抑制，而不是MAPK的激活作用实现的。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-8
缩写目录  8-9
第一部分  9-44
  ErbB受体及配体  10-21
  ErbB受体及配体在发育中的作用  21-23
  信号转导机制  23-31
  ErbB受体相关的药物开发及应用  31-35
  结束语  35-36
  参考文献  36-44
第二部分  44-70
  前言  45-47
  材料与方法  47-49
  结果  49-65
  讨论  65-66
  参考文献  66-70
第三部分  70-99
  前言  71-73
  材料与方法  73-74
  结果  74-91
  讨论  91-94
  参考文献  94-99
完成的论文和专利  99-100
致谢  100-101

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生物化学
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