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人血管内皮生长因子受体-2基因（KDR）在链霉菌和大肠杆菌的克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究

作　者: 刘春平
导　师: 李元
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 博士论文 医科大学 链霉菌 酪氨酸激酶抑制剂 受体酪氨酸激酶 磷酸化反应 信号传导 血管内皮细胞 大肠杆菌表达 激酶活性
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 107次
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内容摘要


血管生成是毛细血管从已构建的毛细血管网中以出芽方式新生的过程,参与许多病理和生理过程如伤口愈合、组织再生、子宫内膜周期性增生以及肿瘤的转移和血管生成。尤其在实体瘤的恶性生长和转移中,肿瘤的血管生成起到重要的作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原,直接参与了血管形成这个过程,促进内皮细胞分裂增殖,促使新生血管形成,同时还可有效地提高血管的通透性。VEGF这一功能是通过和其特异性受体结合来发挥作用的。VEGF受体家族主要包括三个成员:VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）、VEGFR-3（Fit-4）,它们都属于受体酪氨酸激酶（RTK）Ⅲ型超家族。研究表明VEGFR-2（KDR/Flk-1）在调节内皮细胞增殖、分化反应中最为重要,是内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者,VEGF与KDR结合使受体二聚体化,进一步激发KDR酪氨酸发生磷酸化,导致自身酶活性和下游信号相关酶类的激活,从而调节血管内皮细胞相关反应。新生血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素,因而以KDR为靶点进行药物设计和筛选可成为抗肿瘤血管生成的重要方略。KDR基因全长5821bp,编码基因位于4q12,编码区为4068bp,编码1356个氨基酸。由胞外7个Ig样结构域,一个跨膜域和胞内域组成。胞外域由766个氨基酸组成,第2-3Ig样结构域是主要VEGF结合区。KDR胞内区有565个氨基酸组成,可分为激酶功能区、68个氨基酸的酪氨酸激酶插入区和羧基末端。本研究从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中提取总RNA,以其为模板,通过RT-PCR扩增获得编码KDR编码胞外区1-3Ig样结构域（KDR-ED）和胞内酪氨酸激酶催化区域（KDR-CD）的基因片段。测序结果同已知KDR基因编码序列进行比较,结果一致。以链霉菌为表达体系进行基因表达。利用本实验室自行构建的新型链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pSGLgpp作为KDR-ED和KDR-CD的基因表达载体。将KDR-ED和KDR-CD编码基因分别克隆至载体的gpp信号肽编码序列下游。重组质粒转化至S.lividans TK24原生质体,经再生得到转化子,重组菌分别命名为S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]和S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]。SDS-PAGE结果表明,S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]分泌表达44kD的特异蛋白条带。采用磷酸化的酪氨酸抗体在没有加入ATP的情况下对KDR-CD蛋白进行western blot检测,结果出现44kD的单一杂交带,表达的KDR-CD具有免疫学活性。S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]可能分泌表达37KD的重组KDR-ED。此外在大肠杆菌中也分别进行了KDR-ED和KDR-CD编码基因的克隆表达。将KDR-CD基因克隆至载体pET-30a,获得重组质粒pET-30a/KDR-CD并转化至大肠杆菌BL21（DE3）。SDS-PAGE分析显示在41kD处有特异性蛋白条带出现,大部分以包涵体的形式存在。采用磷酸化的酪氨酸抗体进行Western blot检测,全菌及超声破碎的上清和包涵体均在41kD处有单一杂交带,说明表达的KDR-CD重组蛋白具有免疫活性。将KDR-ED基因分别采用载体pET-30a和载体pBV220,在大肠杆菌中均未获表达。分别对链霉菌和大肠杆菌表达的重组KDR-CD蛋白进行纯化。S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]的培养上清液经70%饱和硫酸铵沉淀、SP SepharoseFF阳离子交换树脂层析和Q Sepharose FF阴离子交换树脂层析,获得KDR-CD纯品。E.coli[pET-30a/KDR-CD]产生的重组蛋白,经尿素溶解再进行复性处理后,进行Ni2+—螯合亲和层析得到具有免疫活性的纯化重组蛋白。两种宿主表达的重组的KDR-CD纯化后进行SDS-PAGE分析,HPLC检测纯度均达到95%,且具有免疫活性。采用ELISA方法研究纯化的KDR-CD蛋白的酪氨酸激酶活性,以poly（E4Y）为反应底物,对反应条件包括KDR-CD浓度、底物浓度、ATP及Mg2+和Mn2+的浓度进行了优化,结果表明两种体系表达的KDR-CD蛋白均具有酪氨酸激酶活性。以纯化的KDR-CD蛋白为靶位,建立了KDR酪氨酸激酶的抑制剂筛选模型,已筛选了600余株微生物产物,经复筛获得了13株产生抑制物质的菌株,阳性率为2.17%。本研究首次在链霉菌中成功分泌表达了KDR-CD的酪氨酸激酶催化域,并首次以原核系统表达的重组KDR蛋白构建了筛选酪氨酸激酶抑制剂的新型模型,具有较突出新颖性和可操作性,为从微生物来源获得抗肿瘤血管形成的新药奠定了基础。

全文目录


缩略语一览表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-13
材料与方法  13-30
结果与讨论  30-95
  一 KDR胞内酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)编码基因在链霉菌中的克隆和表达  30-40
  二 KDR胞内酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)基因在大肠杆菌中的克隆和表达  40-50
  三 重组KDR-CD蛋白的纯化研究  50-62
  四 KDR-CD蛋白酪氨酸激酶活性测定及其抑制剂筛选模型的建立  62-82
  五 KDR胞外区卫1-3Ig样结构域(KDR-ED)基因在链霉菌中的克隆和表达  82-91
  六 KDR胞外1-3Ig样结构域(KDR-ED)基因在大肠杆菌中的克隆和表达  91-95
结论  95-98
参考文献  98-101
综述:血管内皮生长因子受体-2生物学及信号传导的研究进展  101-140
  参考文献  130-140
致谢  140

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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