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米渣蛋白的制备及其酶法改性研究

作　者: 王章存
导　师: 姚惠源
学　校: 江南大学
专　业: 粮食、油脂与植物蛋白工程
关键词: 大米蛋白 米渣分离蛋白 蛋白质制备 酶水解 糖蛋白 物化性质 亚基
分类号: TS201.2
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


本论文以淀粉糖生产中的副产品米渣为原料,对米渣蛋白的制备方法、结构特征、酶法改性和酶水解机理等进行了系统研究,旨在探讨制备高纯度米渣蛋白技术,改善蛋白的物化功能,为开发利用米渣蛋白资源提供技术基础。分析表明,与大米相比,米渣中的清、球、醇溶和谷蛋白含量明显降低,碱溶液只能溶出米渣中48%的蛋白质(称为米渣谷蛋白,RDG)。米渣中胱氨酸、蛋氨酸含量分别比大米粉谷蛋白(RFG)中相应氨基酸提高83%和81%,RDG中胱氨酸、蛋氨酸分别比米渣降低23%和37.8%,表明-S-S-是影响米渣蛋白质溶解的内在因素,高温加热是大米蛋白严重变性的重要原因。基于米渣蛋白的特点,提出了用纯化工艺制备高纯度米渣蛋白的思路,本文系统地研究了制备高纯度米渣蛋白的纯化工艺和条件。结果表明,α-淀粉酶水解法所得到的蛋白含量高达86%(称作米渣分离蛋白,RPI),其中17种氨基酸的含量为79.13%,蛋白质回收率达93%,而且通过酶水解过程中低聚糖组分变化和蛋白质形态观察研究了纯化过程中糖与蛋白质的分离机制。研究了所制备的RPI分子大小、亚基组成、蛋白与糖的结合性质等结构特征。HPLC和Sepharose CL-4B凝胶色谱分析表明,RFG中主要是93KDa以下的蛋白质组分,而RPI中主要是115KDa-211KDa的大分子;两种蛋白的亚基组分具有相近的结构和性质,说明RPI通过二硫键的连接形成了高聚体,并进而影响了它的溶解性能。凝胶色谱和IR光谱分析表明,RPI和RFG是糖蛋白,且RPI中的糖含量较高,表明高温加热促进了RPI中蛋白质与糖的结合。GC分析表明糖的成分是葡萄糖和阿拉伯糖,二者含量之比约为4.3:1;β-消去反应证明蛋白与糖以N-糖肽键方式连接;赖氨酸分析表明RPI中发生了Maillard反应。所以糖类物质的存在是米渣蛋白不溶的又一重要原因。SDS-PAGE分析显示RPI中有7条谱带(其中13KDa和38KDa含量较高), RFG中有8条谱带, RPI亚基有很强的重新聚合成大分子的能力,再次说明,-S-S-的存在是米渣蛋白质不溶的重要原因。CD分析显示RPI中α-螺旋、β-转角和自由回转结构分别占5.6%、42%和42%,而RFG中分别为17.75、0和82.3%,表明高温变性的RPI二级结构与未变性的RFG有显著差异。研究了蛋白酶法水解对RPI溶解、乳化和发泡性质的影响。单一的碱性蛋白酶对米渣蛋白的水解不如碱性蛋白酶和复合蛋白酶共同作用时的水解效果好;通过数学软件分析了不同酶水解条件与蛋白质物化性能间的关系,当复合蛋白酶0.02%、碱性蛋白酶0.08%和反应时间2.5h,蛋白质溶解度可达56.62%,乳化活性(OD值)为0.493,发泡性为175ml。蛋白质组分的相对分子质量及其含量分析表明,适当大小的酶水解物分子有利于表现乳化和发泡性能。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略表  13-14
第一章 绪论  14-28
  1.1 大米蛋白的营养、保健作用  14-15
  1.2 大米蛋白的结构特征和性质  15-19
    1.2.1 大米蛋白的分子和亚基组成  15-17
    1.2.2 大米蛋白的存在状态  17-18
    1.2.3 加热和陈化作用对大米蛋白的影响  18-19
  1.3 大米蛋白开发利用现状  19-22
    1.3.1 大米蛋白提取技术  19-20
      1.3.1.1 米粉中蛋白质的提取  19-20
      1.3.1.2 米渣中蛋白质的提取  20
    1.3.2 大米蛋白的产品开发  20-22
      1.3.2.1 大米蛋白营养补充剂  20-21
      1.3.2.2 功能肽的开发  21
      1.3.2.3 食品添加剂  21-22
  1.4 本课题立题意义和研究内容  22-23
    1.4.1 本课题的立题背景和意义  22
    1.4.2 本课题主要研究内容  22-23
  参考文献  23-28
第二章 米渣蛋白制备工艺研究  28-44
  2.0 前言  28
  2.1 实验材料和方法  28-30
    2.1.1 实验材料和主要试剂  28
    2.1.2 主要仪器  28-29
    2.1.3 实验方法  29-30
      2.1.3.1 原料中四种蛋白组分的提取分离  29
      2.1.3.2 常规成分分析  29
      2.1.3.3 温度和pH值对米渣中蛋白和糖溶解性能的影响  29-30
      2.1.3.4 固液比对米渣蛋白质溶解性能影响  30
      2.1.3.5 米渣蛋白制备工艺  30
      2.1.3.6 氨基酸分析  30
      2.1.3.7 淀粉酶水解过程中糖成分分析  30
      2.1.3.8 电镜扫描图谱  30
  2.2 实验结果和讨论  30-41
    2.2.1 米渣成分含量分析  30-32
      2.2.1.1 常规成分含量分析  30-31
      2.2.1.2 米渣中四种蛋白质含量分析  31
      2.2.1.3 米渣蛋白氨基酸含量分析  31-32
    2.2.2 米渣中蛋白和糖类物质的溶解性能  32-34
      2.2.2.1 温度和pH对米渣蛋白质溶解度的影响  32-33
      2.2.2.2 温度和pH对米渣中总糖溶解度的影响  33-34
      2.2.2.3 固液比对米渣蛋白质和总糖溶解性的影响  34
    2.2.3 米渣蛋白质的制备  34-39
      2.2.3.1 水洗法脱糖  34-35
      2.2.3.2 β-淀粉酶和普鲁兰酶脱糖试验研究  35-36
      2.2.3.3 α-淀粉酶水解脱糖  36-39
    2.2.4 纯化工艺提高蛋白质含量的机理  39-41
      2.2.4.1 α-淀粉酶水解过程中糖组分分析  39-40
      2.2.4.2 米渣蛋白提取物的SEM观察  40-41
  2.3 本章小结  41-42
  参考文献  42-44
第三章 米渣分离蛋白结构特征研究  44-64
  3.0 前言  44
  3.1 试验材料和方法  44-47
    3.1.1 主要材料和试剂  44-45
    3.1.2 主要仪器  45
    3.1.3 实验方法  45-47
      3.1.3.1 高效液相色谱(HPLC)测定蛋白质相对分子质量  45
      3.1.3.2 Sepharose CL-48凝胶柱色谱  45-46
      3.1.3.3 单糖组成分析  46
      3.1.3.4 糖与蛋白结合方式研究  46
      3.1.3.5 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  46
      3.1.3.6 CD光谱法  46
      3.1.3.7 红外光谱  46
      3.1.3.8 氨基酸含量分析  46-47
  3.2 实验结果和讨论  47-61
    3.2.1 米渣分离蛋白的相对分子质量(Mr.)  47-50
      3.2.1.1 HPLC 分析  47-48
      3.2.1.2 碱性条件下米渣蛋白的凝胶色谱分析  48-49
      3.2.1.3 加巯基乙醇(ME)时的凝胶色谱  49-50
    3.2.2 米渣分离蛋白的化学结构--蛋白质与糖的结合性质  50-57
      3.2.2.1 蛋白质与糖的凝胶色谱分析  51-52
      3.2.2.2 米渣分离蛋白中结合糖的种类  52-54
      3.2.2.3 蛋白与糖的结合方式  54-55
      3.2.2.4 红外光谱分析  55-57
    3.2.3 蛋白质的亚基构成(SDS-PAGE)  57-59
    3.2.4 蛋白质二级结构分析-CD光谱  59-61
  3.3 本章小结  61
  参考文献  61-64
第四章 米渣蛋白的酶法改性研究  64-80
  4.0 前言  64
  4.1 实验材料和方法  64-66
    4.1.1 实验材料和试剂  64
    4.1.2 仪器和设备  64-65
    4.1.3 实验过程和分析方法  65-66
      4.1.3.1 不同蛋白酶的催化反应进程  65
      4.1.3.2 酶反应条件研究  65
      4.1.3.3 发泡性及发泡稳定性  65
      4.1.3.4 乳化性和乳化稳定性  65-66
      4.1.3.5 水解度测定  66
      4.1.3.6 Superdex 200凝胶色谱  66
      4.1.3.7 HPLC法测定肽的相对分子质量  66
  4.2 试验结果和讨论  66-78
    4.2.1 蛋白酶制剂的选择  66-67
    4.2.2 影响酶反应的因素及酶催化动力学  67-70
      4.2.2.1 酶浓度对水解反应的影响  67-68
      4.2.2.2 底物浓度的影响和米氏方程  68-70
    4.2.3 碱性蛋白酶水解条件的优化  70
    4.2.4 两种蛋白酶共同水解条件的研究  70-75
      4.2.4.1 加酶方式对反应进程的影响  71
      4.2.4.2 两种酶水解条件的优化  71-75
    4.2.5 不同水解条件的酶水解物表现不同物化性质的原因分析  75-78
      4.2.5.1 水解度与酶水解物性质间的关系  75-76
      4.2.5.2 蛋白酶水解物的相对分子质量  76-78
  4.3 本章小结  78
  参考文献  78-80
第五章 米渣蛋白的酶法水解机理研究  80-98
  5.0 前言  80
  5.1 试验材料和方法  80-82
    5.1.1 试验材料  80-81
    5.1.2 主要仪器  81
    5.1.3 实验方法  81-82
      5.1.3.1 蛋白质溶解度测定  81
      5.1.3.2 水解度(DH)测定  81
      5.1.3.3 酶水解物凝胶柱色谱分析  81
      5.1.3.4 酶水解物相对分子质量测定  81-82
      5.1.3.5 SDS-PAGE分析  82
      5.1.3.6 糖蛋白的Schiff试剂法染色  82
      5.1.3.7 糖蛋白的麝香草酚染色  82
      5.1.3.8 糖与蛋白质的结合方式  82
      5.1.3.9 氨基酸组成  82
      5.1.3.10 红外光谱测定  82
      5.1.3.11 扫描电镜照片  82
  5.2 试验结果和讨论  82-94
    5.2.1 反应系统中酶在不溶性蛋白表面和溶液中的分配  82-85
      5.2.1.1 酶反应中蛋白溶出浓度和水解度关系  83-84
      5.2.1.2 相同DH而加酶量不同时的多肽组分比较  84-85
    5.2.2 酶水解对蛋白质分子特征的影响  85-90
      5.2.2.1 可溶物蛋白质的凝胶色谱分析  85-86
      5.2.2.2 酶水解对蛋白质亚基的影响  86-88
      5.2.2.3 可溶物和残余物的氨基酸组成分析  88-89
      5.2.2.4 酶水解对米渣蛋白二级结构的影响-圆二色光谱分析  89-90
    5.2.3 酶水解对RPI糖-蛋白结合性质的影响  90-93
      5.2.3.1 可溶性蛋白和糖的凝胶色谱分析  90-91
      5.2.3.2 可溶性蛋白质与糖的结合方式  91
      5.2.3.3 残余物的糖结合性质-SDS-PAGE对糖蛋白的鉴定  91-92
      5.2.3.4 可溶物和残余物的红外光谱分析  92-93
    5.2.4 水解后残余物的扫描电镜观察  93-94
  5.3 本章小结  94-95
  参考文献  95-98
第六章 米渣蛋白酶水解物的应用性质  98-111
  6.0 前言  98
  6.1 实验材料和方法  98-100
    6.1.1 主要材料  98
    6.1.2 主要仪器  98-99
    6.1.3 实验方法  99-100
      6.1.3.1 HRPI溶解性能  99
      6.1.3.2 发泡性及发泡稳定性  99
      6.1.3.3 乳化活性和乳化稳定性  99
      6.1.3.4 糖类物质和NaSO对乳化性能的影响  99
      6.1.3.5 乳化相中蛋白组分的提取  99
      6.1.3.6 蛋白组分相对分子质量测定  99
      6.1.3.7 氨基酸分析  99-100
  6.2 实验结果和讨论  100-109
    6.2.1 米渣蛋白酶水解物(HRPI)的物化性质  100-104
      6.2.1.1 pH值对HRPI溶解性的影响  100
      6.2.1.2 pH值对HRPI发泡性能的影响  100-101
      6.2.1.3 HRPI的乳化性质研究  101-104
    6.2.2 乳化体系不同相中的蛋白质分子特征  104-109
      6.2.2.1 在pH8.0乳化体系中的蛋白质分子特征  105-107
      6.2.2.2 在pH10.0乳化体系中的蛋白质分子特征  107-109
  6.3 本章小结  109
  参考文献  109-111
论文的主要结论和创新点  111-115
攻读博士学位期间发表论文情况  115-116
致谢  116

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品化学
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