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叶卷曲基因调控机制的研究

作　者: 余琳
导　师: 何玉科
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 遗传学
关键词: 大白菜(Brassica campestris ssp .pekinensis) 拟南芥(Arabidopsis thaliana) BcpLH 基因 HYL1 基因 hyl1 突变体极性激素 microRNA(miRNA) 双链RNA 结合结构域(DSRM) 叶卷曲叶球
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

叶的极性建立直接决定了叶的平展性(Flatness)发育。极性改变会破坏大多数植物叶的平展性,影响植物体的光和作用、蒸腾作用和抗逆性等生理功能。与此同时,叶的卷曲对一些作物来说是一种非常有用的农艺性状。大白菜、甘蓝和抱子甘蓝等蔬菜作物的可食用器官是叶球,这些叶球的发育过程表现为叶片向上向内卷曲。了解叶极性或叶卷曲发生的遗传规律,揭示这一重要过程的基因调控机制,对于遗传上控制叶的姿态和形态,发展叶发育的重要理论,改良叶平展度或卷曲度等遗传性状,提高农作物产量和品质有重要的理论意义和实用价值。早在1996 年,我们实验室利用差异杂交的方法在大白菜中分离和克隆了双链RNA 结合蛋白基因BcpLH,并初步发现它与叶卷曲的发生相关(Yu 等,2000)。本项研究将综合国内外近年来叶极性和叶卷曲发生方面的最新进展,利用大白菜BcpLH 基因和模式植物拟南芥同源基因HYL1,通过比较生物学的方法探讨叶卷曲发生的基因调控机制。首先,我们选择了拟南芥hyl1 突变体(Lu 和Fedoroff, 2000)为实验材料,通过对其叶脉模式和近远轴极性等叶发育相关性状的观察,探讨HYL1 基因对叶卷曲发生调控的可能机制。和野生型相比,hyl1 突变体具有向上卷曲(偏下性生长)的叶片特征,次级叶脉的复杂度降低而且常常出现断裂的现象。在hyl1 突变体叶卷曲发生突出的侧部区域,叶肉细胞的近远轴极性丧失,表现出栅栏细胞和海绵细胞的混乱。但表皮细胞的近远轴极性并没有改变,而只是远轴面的细胞数目减少,细胞面积变大。然后,我们构建了HYL1 启动子和GUS 报告基因融合的植物表达载体,浸花法转化拟南芥,分析了pHYL1::GUS 转基因植株中GUS 的活性。结果表明,其启动子的表达还是有特异性的,我们在真叶、叶柄和脉络系统中都能检测到GUS 的活性,并随着叶片的展开和成熟,表达部位从整片叶子缩小到叶片的基部。在转基因茎生叶中的表达趋势和莲座叶一致,在花蕾中主要在萼片和雄蕊中表达;开花后,GUS 活性局限在花托和花柄的交界及雄蕊中表达,角果幼胚中也能检测到GUS 活性。利用半定量RT-PCR 和原位杂交的方法,对REV 和FIL 基因的表达方式进

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
第一部分:文献综述  13-39
  文献综述I:叶卷曲发生的分子机制  14-27
    一、叶卷曲突变体  14-17
    二、叶卷曲发生的可能机制  17-21
      (一) 基因控制  17-20
        (1) 细胞的分裂和生长的基因调控  17-18
        (2) 细胞分化导致极性产生的基因调控  18-19
        (3) AGAMOUS 基因的异位表达  19-20
      (二) 激素控制  20
      (三) 环境控制  20-21
    三、结束语  21-22
    参考文献  22-27
  文献综述II:microRNA 在植物侧生器官极性建立过程中的调控作用  27-39
    一、植物侧生器官的极性建立  27-29
    二、植物中miRNAs 的产生和成熟  29-31
    三、miRNA 与植物器官的极性建立  31-34
    四、结束语  34-35
    参考文献  35-39
第二部分:研究论文  39-121
  第一章 HYL1 基因与拟南芥叶卷曲的发生  40-77
    引言  40-43
    一、材料和方法  43-62
      (一) 质粒和菌株  43
      (二) 植物材料  43
      (三) 试剂和引物  43-45
      (四) 方法  45-62
        (1) 植物材料的种植  45
        (2) 叶相关系数的统计  45-46
        (3) 扫描电镜  46
        (4) 石蜡切片植物组织观察  46-47
        (5) 暗视野显微镜样品制备及观察  47-48
        (6) CTAB 法植物组织总DNA 的提取植物材料的种植  48-49
        (7) 质粒的提取  49
        (8) HYL1 基因启动子的分离及pHYL1::GUS 融合基因载体的构建  49-50
        (9) 热激法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  50
        (10) 冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化  50-51
        (11) 浸花法转化拟南芥及筛选  51-52
        (12) TPS 法小量提取植物组织DNA  52
        (13) 组织化学染色法(GUS 活性检测)  52-53
        (14) 植物组织总RNA 提取  53
        (15) 半定量RT-PCR  53-54
        (16) microRNA northern 杂交  54-56
        (17) 原位杂交探针的构建  56
        (18) 原位杂交  56-62
    二、结果分析  62-71
      (一) hy11 突变体叶片相关表型的进一步观察和分析  62-64
      (二) hy11 突变体的叶脉简化  64-65
      (三) hy11 突变体叶片极性的部分改变  65-67
      (四) HYL1 基因与miRNA 和叶极性决定基因的相互关系  67-70
      (五) HYL1 基因启动子的表达特征  70-71
    三、讨论  71-74
      (一) hy11 的叶片在横向和纵向表现出不同的卷曲程度  71
      (二) HYL1 调控叶脉和叶极性的正常发育  71-74
    参考文献  74-77
  第二章 HYL1 蛋白不同结构域的生物学功能  77-100
    引言  77-81
    一、材料和方法  81-85
      (一) 质粒和菌株  81
      (二) 植物材料  81
      (三) 试剂和引物  81-83
      (四) 方法  83-85
        (1) 植物材料的种植  83
        (2) HYL1 基因缺失片断的扩增及双元载体的构建  83
        (3) 浸花法转化拟南芥及筛选  83
        (4) 半定量RT-PCR 鉴定外源基因的表达  83-84
        (5) 不同转基因拟南芥中miR165 和miR160 的Northern 杂交  84
        (6) 转基因植株叶卷表型的观察及对不同外源激素的反应分析  84-85
    二、结果分析  85-93
      (一) HYL1 基因缺失片断的构建及转基因植株的表型观察  85-89
      (二) HYL1 基因缺失片断转基因植株对不同激素的生理反应  89-92
      (三) HYL1 基因缺失片断转基因植株的miRNA 累积  92-93
    三、讨论  93-95
      (一) HYL1 蛋白在体内的生物学功能主要由其两个DSRM 结构域完成  93
      (二) HYL1 对叶平展的调控和对激素的反应是由miRNA 介导的  93-95
    参考文献  95-100
  第三章大白菜中BcpLH 基因的生物学功能  100-121
    引言  100-102
    一、材料和方法  102-107
      (一) 质粒和菌株  102
      (二) 植物材料  102
      (三) 试剂和引物  102-104
      (四) 方法  104-107
        (1) 植物材料的种植  104
        (2) BcpLH 基因缺失片断的扩增及双元载体的构建  104
        (3) BcpLH-GFP 融合载体构建及亚细胞定位  104
        (4) 浸花法转化拟南芥及筛选  104-105
        (5) 真空抽滤法转化大白菜及筛选  105
        (6) 转基因植株叶卷曲表型的观察及对不同外源激素的反应分析  105
        (7) miR165 和miR160 的Northern 杂交  105
        (8) 半定量RT-PCR  105-106
        (9) 实时定量PCR  106
        (10) 组织切片  106-107
    二、结果分析  107-118
      (一) 大白菜BcpLH 基因与拟南芥HYL1 基因的功能一致  107-110
      (二) BcpLH 基因定位在核中  110
      (三) 结球型大白菜不同时期叶片组织的切片观察  110-112
      (四) 结球型大白菜和散叶型大白菜结球期顶端组织的切片观察  112-113
      (五) BcpLH 基因不同时期的表达分析  113-114
      (六) 转基因大白菜的获得及分子鉴定  114-116
      (七) 正义和反义BcpLH 转基因大白菜的表型观察  116-118
    三、讨论  118-120
    参考文献  120-121
论文发表情况  121-122
致谢  122

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