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白菜类蔬菜叶球发育相关基因的分子克隆及其转基因植物研究

作　者: 薛万新
导　师: 王鸣；何玉科
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 蔬菜学
关键词: BcpLH基因 BccLH基因 原位真空抽滤法 子房注射法 转基因植物 花粉管通道法 Silwet L－77 进化树 RNA结合蛋白 拷贝数 叶球发育 小白菜 大白菜
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


根据大白菜BcpLH基因设计一对引物，以小白菜基因组DNA为模板，进行BcpLH同源基因扩增，扩增产物命名为BccLH基因。从基因组、cDNA、氨基酸、蛋白质结构等多个方面比较了大白菜BcpLH基因和小白菜BccLH基因的差异。BccLH基因序列全长为1544bp，与大白菜BcpLH基因序列同源性96.1％。Southern杂交结果显示，小白菜基因组中只有1个拷贝的BccLH基因。该基因与大白菜中BcpLH基因一样，也包含2个内含子和3个外显子，BccLH基因与大白菜BcpLH基因比较，第三个外显子的基因序列存在较大的差异，发生多处碱基替换或者缺失，尤其是在ATG下游1427-1448bp处，有连续21个碱基缺失(对大白菜而言)，在其它三个位置还分别有1、2、3个碱基缺失。此外，第三个外显子内共有28处发生了碱基替换。序列其它位置则相对保守。因此，小白菜与大白菜在结球性状上的差异很可能是由于第三个外显子内碱基的这种变化引起的。 BccLtt基因的cDNA序列为一全长cDNA，读码框包含852个碱基，比大白菜多出27个碱基。该cDNA与大白菜BcpLH基因cDNA同源性分别为93.3％，由BccLtt基因cDNA推导的氨基酸序列全长为283个氨基酸，比大白菜多9个氨基酸，其中从第248个氨基酸处开始，大白菜出现有7个连续的氨基酸序列缺失，即-P-E-N-A-E-T-M，此外，在其它一些位置还有12个氨基酸代换和2个氨基酸插入。两个基因的蛋白质序列之间的同源性为92.9％。通过数据库进行同源性比较，除了大白菜和结球甘蓝以外，还没有发现与BccLH基因高度同源的已知基因。但与大白菜一样，BccLtt基因的多肽链中有2个片段与双链RNA结合结构域(DRBM)一致，只是在第二个片段存在有一个氨基酸的差异。BccLH的两个DRBM与人类RNA结合蛋白TRBP的对应区域分别有51％和59％的一致性。BccLH基因的蛋白质二级结构与BcpLH基因蛋白质二级结构在第250个氨基酸之前完全一致，此后存在一定的差异。这也可能是导致大白菜与小白菜在发育过程中产生不同发育方向的重要原因之一。 根据BcpLH同源cDNA序列的同源性绘制了大白菜、小白菜、油菜、拟南芥、甘蓝、水稻等6种作物的8个同源基因的进化树。进化树与普通植物学分类基本一致，并从分子水平上揭示了它们的进化和分类关系。 通过非组织培养遗传转化方法将BcpLH正义基因和BcpLH反义基因分别转入小白菜和大白菜，研究BcpLH基因对叶球形态发生的调节功能。大白菜通过真空抽滤法转化频率达到0.63％；小白菜子房注射法转化频率达到1.8％。组培法初步筛选的抗性苗切去基部后，在MS+NAA0.5mg/L的培养基上可实现大量生根，生根苗移栽成活率大大提高。采用水培法筛选， 西北农林科技大学博士学位论文2并通过移栽后复选是一个较好的筛选方法，该法操作简便，单位时间筛选种子数多，筛选效率高。水培法筛选大白菜转化体时，卡那霉素适宜的浓度为 50ug／thl，小白菜为 40Ug／llil。所得抗性苗中7株经分子检测，有4株被确定有外源基因的导人。转p正义基因大白菜有提早提早包0的趋势，其性状有待进一步观察。转BoLH反义基因大白菜出现先期抽至变异。转正义基因小白菜无明显表型变化。 大白菜原位真空抽滤法遗传转化影响因素的研究表明，初花期的转化频率最高。大白菜种于经过 2℃低温处理 20天，并于 12月 8日播种，60天后可建成原位真空抽滤转化的适宜苗态。大白菜和小白菜经2M305断续抽滤，转化频率相对较高。不同的菌液浓度处理间抗性苗获得率无明显规律。真空抽滤转化中，渗人培养基中蔗糖是必需的，浓度为5％时转化频率最高。表面活性剂 Silwet L－77对转化频率有较大的影一，渗入培养基中用 0．02％Silwet L－77与 5％蔗糖配合，转化频率达2％。28℃转化效果明显优于20℃。去顶苔处理、重复抽滤等对转化频率的影响不大。

全文目录


中文摘要  10-12
英文摘要  12-15
综述  15-58
  第一部分 叶球发育机理  16-22
    1．1 植物的器官分化和器官异态  16
    1．2 大白菜的进化过程及叶球发育  16-17
    1．3 大白菜叶球形成的机理  17-21
      1．3．1 形态学机理  17
      1．3．2 分化起源学说  17
      1．3．3 杂交起源学说  17-18
      1．3．4 生理机制  18
      1．3．5 生态生理学说  18-19
        1．3．5．1 温度  18
        1．3．5．2 光照  18-19
        1．3．5．3 矿质营养  19
        1．3．5．4 水分  19
        1．3．5．5 土壤  19
      1．3．6 大白菜叶球发育相关基因BcpLH基因的研究现状  19-21
        1．3．6．1 大白菜叶球发育相关基因BcpLH基因的分离及序列特征  19
        1．3．6．2 BcpLH基因结构特征  19-20
        1．3．6．3 BcpLH基因的表达特征  20
        1．3．6．4 拟南芥BcpLH同源基因的序列特征  20
        1．3．6．5 甘蓝中BcpLH基因同源基因的序列以及表达特征  20-21
    参考文献  21-22
  第二部分 RNA结合蛋白的结构特征及生物学功能  22-37
    1． RNA结合蛋白的结构  22-27
      1．1 RNA结合结构域（RNA-binding domains）  22-25
        1．1．1 RNP花式（RNP motif）  22-23
        1．1．2 kH花式（K homology motif）  23-24
        1．1．3 双链RNA结合花式（Double-Stranded RNA-Binding Motif/DSRM）  24-25
        1．1．4 精氨酸丰富的花式（The Arginine-Rich Motif/ARM）  25
      1．2 RNA结合蛋白中的附属结构域（auxiliary domains）  25-27
        1．2．1 富含甘氨酸的结构域  25-26
        1．2．2 SR结构域  26
        1．2．3 RNA结合蛋白附属结构的作用  26-27
    2． RNA结合蛋白起转最后调节作用的机制  27-29
      2．1 RNA的稳定和降解  27
      2．2 RNA的翻译控制  27-28
      2．3 RNA的编辑  28
      2．4 RNA的贮存和定位  28-29
    参考文献  29-37
  第三部分 植物外源基因整合及遗传特性研究进展  37-47
    1 转基因植物中外源DNA的整合特性  37-39
      1．1 整合位点  37
      1．2 整合的拷贝数  37-38
      1．3 外源基因对植物基因组基因结构的影响  38
      1．4 外源基因的大小及T-DNA对基因整合的影响  38-39
    2 转基因植物中外源DNA的表达  39-41
      2．1 外源基因的甲基化与基因失活  39
      2．2 外源DNA整合的位置效应  39-40
      2．3 同源基因的共抑制效应  40
        2．3．1 正义抑制（sense suppression）  40
        2．3．2 反义抑制（anti-sense suppression）  40
      2．4 累加效应  40-41
      2．5 重排效应（rearrangement）  41
    3 转化外源基因的遗传稳定性  41-42
    4 外源基因在转化植株中的遗传传递规律  42-44
      4．1 符合孟德尔的遗传传递  42-43
        4．1．1 单位点插入外源基因的遗传传递规律  42-43
        4．1．2 多位点插入外源基因的遗传传递规律  43
        4．1．3 纯合致死  43
      4．2 不符合孟德尔的遗传传递  43-44
    参考文献  44-47
  第四部分 十字花科植物遗传转化技术  47-56
    1 新技术在十字花科植物农杆菌转化法中的应用  47-48
      1．1 苯基脲类细胞分裂素的应用  47
      1．2 两步法代替了一步法  47
      1．3 AgNO3对不定芽诱导的促进作用  47-48
      1．4 拟菌抗生素的选择  48
      1．5 筛选方法与筛选标记  48
      1．6 利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）防止褐化  48
      1．7 利用乙酰丁香酮（AS）提高转化频率  48
    2 利用非组培方法进行十字花科植物遗传转化的研究进展  48-53
      2．1 真空原位抽滤法  49-50
        2．1．1 原位真空抽滤法的转化系统  49-50
          2．1．1．1 转化时期  49
          2．1．1．2 转化的真空度及转化时间  49
          2．1．1．3 转化菌液浓度  49
          2．1．1．4 渗入培养基  49
          2．1．1．5 转化体的筛选  49-50
        2．1．2 原位真空抽滤法转化频率  50
        2．1．3 转化株的拷贝数、表现及遗传  50
        2．1．4 转化途径  50
      2．2 蘸花法（floral dip）  50-51
        2．2．1 转化方法  50
        2．2．2 主要结论  50-51
          2．2．2．1 转化时期  50
          2．2．2．2 转化培养基  50
          2．2．2．3 重复蘸花  50-51
          2．2．2．4 菌液浓度  51
          2．2．2．5 菌液的生长时期  51
          2．2．2．6 转化后植株培养  51
          2．2．2．7 植物生态型的影响  51
          2．2．2．8 不同的农杆菌菌株的影响  51
          2．2．2．9 筛选培养基  51
          2．2．2．10 转化频率  51
      2．3 滴涂法  51-52
        2．3．1 转化方法  51
        2．3．2 主要结论  51-52
          2．3．2．1 去顶苔处理  51-52
          2．3．2．2 筛选培养基及抗生素  52
          2．3．2．3 环境条件  52
          2．3．2．4 种子收获  52
          2．3．2．5 转化效率  52
          2．3．2．6 遗传规律  52
      2．4 种子共培养法  52-53
        2．4．1 种子共培养方法  52-53
        2．4．2 技术关键以及主要结论  53
          2．4．2．1 预培养时间  53
          2．4．2．2 筛选方法  53
          2．4．2．3 转化体遗传规律  53
          2．4．2．4 分子检测结果  53
          2．4．2．5 转化频率  53
    参考文献  53-56
  第五部分 选题意义及技术路线和研究目标  56-58
    1． 选题意义  56
    2． 技术路线  56-57
    3． 研究目标  57-58
正文  58-108
  第一章 小白菜中BcpLH同源基因的分子克隆及序列分析  59-85
    摘要  59-60
    Abstract  60-62
    1． 材料和方法  62-67
      1．1 植物材料  62
      1．2 酶、试剂和载体和菌株  62
      1．3 DNA提取方法  62-64
      1．4 引物的设计与合成  64
      1．5 BcpLH同源基因的PCR扩增和PCR产物的克隆  64-65
      1．6 感受态细胞的制备、转化及鉴定方法参照《分子克隆》  65-66
      1．7 质粒DNA的提取  66-67
      1．8 连接反应及酶切  67
      1．9 电泳  67
      1．10 Southern杂交  67
      1．11 全序列测定与分析  67
    2 结果与分析  67-79
      2．1 小白菜BcpLH同源基因的扩增及序列分析  68
      2．2 小白菜BcpLH同源cDNA序列分析  68-74
      2．3 小白菜BccLH基因的蛋白质二级结构预测  74
      2．4 小白菜基因组中BccLH基因拷贝数的确定  74-77
      2．5 根据BcpLH基因同源性分析物种进化关系  77-79
    3 结论与讨论  79-81
      3．1 小白菜BccLH基因的序列特征及大白菜叶球发育的分子机制  79-80
      3．2 双链RNA结合蛋白及其生物学功能  80
      3．3 根据BcpLH同源基因的相似性分析几种作物的进化关系  80-81
    参考文献  81-85
  第二章 BcpLH正义基因以及反义基因对小白菜和大白菜的遗传转化  85-108
    摘要  85-86
    Abstract  86-88
    1 材料与方法  88-91
      1．1 材料  88
        1．1．1 植物材料  88
        1．1．2 酶、试剂、载体和菌株  88
      1．2 实验方法  88-91
        1．2．1 菌液培养  88
        1．2．2 菌液稀释  88
        1．2．3 种子低温处理和幼苗准备  88-89
        1．2．4 转化方法  89
          1．2．4．1 原位真空抽滤法  89
          1．2．4．2 子房注射法  89
          1．2．4．3 种子共培养法  89
          1．2．4．4 花粉管通道法  89
          1．2．4．5 蘸花法  89
          1．2．4．6 喷花法  89
          1．2．4．7 种子抽滤法  89
          1．2．4．8 滴涂法  89
        1．2．5 种子收获  89-90
        1．2．6 转化株筛选、生根及移栽  90
          1．2．6．1 组培法筛选  90
          1．2．6．2 水培法筛选  90
          1．2．6．3 浇灌法  90
          1．2．6．4 喷苗法  90
          1．2．6．5 浸种法  90
          1．2．6．6 抗性苗生根  90
          1．2．6．7 抗性苗移栽  90
        1．2．7 质粒DNA提取方法  90
        1．2．8 质粒DNA的酶切及连接  90
        1．2．9 感受态细胞的制备及转化  90-91
        1．2．10 植物DNA的提取  91
        1．2．11 PCR扩增以及转化株检测  91
        1．2．12 电泳  91
    2 结果与分析  91-101
      2．1 载体构建  91-92
      2．2 不同的转化方法比较  92
      2．3 抗性苗筛选方法比较  92-95
        2．3．1 抗生素浓度筛选  92-94
        2．3．2 不同筛选方法的比较  94-95
      2．4 抗性苗生根培养基的筛选  95
      2．5 抗性苗生长表现  95-96
      2．6 抗性苗分子检测  96-97
      2．7 原位真空抽滤法转化系统研究  97-101
        2．7．1 不同的转化时期对转化效果的影响  97
        2．7．2 低温及播种时期对大白菜及小白菜抽薹及苗态建成的影响  97-99
        2．7．3 抽滤时间对转化效果的影响  99-100
        2．7．4 菌液浓度对转化效果的影响  100
        2．7．5 表面活性剂以及蔗糖浓度对真空抽滤转化效果的影响  100-101
        2．7．6 其它因素对转化频率的影响  101
    3 讨论  101-104
      3．1 对大白菜和小白菜不同转化方法的评价  102
      3．2 原位真空抽滤转基因中转化体筛选方法  102-103
      3．3 外源基因整合进植物基因组后的遗传效应  103-104
    4 结论  104-105
    参考文献  105-108
附图  108-114
作者简介  114

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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