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地黄试管块根诱导及茎尖玻璃化法超低温保存

作　者: 薛建平
导　师: 谢从华
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 地黄试管块根内源激素形态建成玻璃化超低温
分类号: S567.2
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生药用草本植物，其新鲜块根或块根的加工品作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，是我国著名的“四大怀药”之一。由于在生产中长期采用块根营养繁殖，地黄易受多种病害的侵袭，其中以病毒侵害最为严重，通常田间感染率达100％，致使地黄品种退化，直接影响药农的经济效益，利用茎尖脱毒培养技术是解决地黄病毒病的最根本途径。然而脱毒苗繁殖系数小、成活率低、育苗周期长，运输极不便利，从而大大限制了其在农业生产上的推广。近年来，人们先后在试管中诱导出了半夏、马铃薯、芋等，试图尝试来替代试管脱毒苗，其中试管马铃薯的培养技术日趋成熟，完全可以替代试管苗作为种用材料，但试管地黄的研究国内外尚未见报道。另外，地黄属异花授粉植物，种子不能用来保种，生产上采用块根来留种，但同样易受气候、栽培条件及病虫害的影响，造成种质退化，甚至丢失。玻璃化冻存法是近年来发展起来的一种植物资源超低温保存方法，但地黄的低温保存研究尚未见报道。因此，本研究选用地黄“85-5”为试验材料，开展了试管地黄的诱导及茎尖玻璃化法超低温保存的初步研究。所取得的主要研究结果如下： 1．试管地黄的形成包括不定根的形成及块根膨大两个主要时期。块根的形成前提必须首先有不定根的发生，低浓度的6-BA和NAA配合使用可诱导植株产生不定根，以MS+6-BA2mg／L+NAA0.1mg／L效果较好。试验发现，在上述基本培养基中添加蔗糖能促进不定根膨大形成块根，和3％蔗糖浓度相比，在含5％和8％蔗糖的高糖培养基中，幼苗叶片深绿平展，苗不伸长，处于生长抑制状态，植株上形成白色短粗的不定根均可膨大形成试管地黄，且发育良好，说明高浓度的蔗糖对不定根膨大形成试管地黄起着至关重要的作用，本试验以5％为宜。在试管地黄的诱导过程中，不宜添加GA₃和活性炭。试管地黄诱导的最适培养条件为培养温度25℃，光照强度2000—3000lx，光照时间12h／d。 2．试管地黄的形态建成与内源生长物质的变化有关。IAA在不定根膨大初期含量呈现下降趋势，20d时开始缓慢上升。GA₃在转苗初期呈现较平稳的趋势，在25-30d时GA₃的含量迅速增长，而后则呈下降趋势，但依然处于较高水平。ABA的含量在10—20d块根膨大时呈缓慢上升趋势，20d—30d块根迅速膨大期迅速增长，30d以后含量较为平稳，较高的内源ABA含量有利于地黄块根的膨大。JA在不定根膨大初期处于较低水平，以后则一直呈缓慢的上升趋势，在试管地黄迅速膨大时期，JA在根中的含量最高，JA在地黄离体块根的形成过程中有可能起着极为重要的作用。 3．以无菌苗叶片为外植体，地黄在组织培养条件下的形态建成受内源生长物质的调控。试验观察到，在MS+6-BA2.0mg／L培养基中可直接诱导小植株的再生，这一过程中，培养初期内源IAA的含量略下降，7d后急剧增长，当不定芽形成后，I从的含量则呈现下降趋势;GA3的含量在培养1一14d呈增高趋势，14d后则急剧下降;JA的含量整体变化幅度不明显。在MS+6一BA 1.omg/L+ NAAo.smg/L培养基中可诱导形成试管地黄，此间IAA含量的变化与诱导植株再生的情况相反，呈快速上升趋势;G凡的含量先明显下降，而14d后上升至刚离体的水平;JA的含量在培养初期l一7d期间急速下降，当不定根形成时，又恢复到原先水平，14d后在不定根膨大形成试管地黄的过程中其含量迅速增长，21d时JA含量是叶片刚离体时的近5倍。两种培养基中叶片在l一14d培养期间，ABA的含量均下降，14d后再上升，但是叶片在诱导植株直接再生的过程中，ABA上升和下降的幅度明显大于叶片诱导形成试管块根时。试验结果说明，内源IAA和G凡对植株的再生起关键作用，而JA和ABA参与了不定根的诱导及其进一步膨大形成试管块根，并且有可能起着极为重要的作用。 4.试管地黄在形态解剖方面与自然条件下生长的地黄具有一致性，两者的成熟结构基本上相同。在横切面上，二者都分为周皮和维管组织两部分，周皮的构成（木栓层、栓内层、木栓形成层）基本一致，维管柱中各种组织细胞在结构或数量上均相似。因此，试管地黄在诱导过程中其结构上未发生明显变化。。 5.建立了地黄茎尖超低温保存的技术体系。切取10mlll长的地黄脱毒苗茎尖接种于含0.2一0.6mol/L蔗糖的MS培养基上，并添加l%一5%乙酞胺、5%DMSO;在黑暗、10℃条件下预培养l一5d后，切取0.5一3.snun长的茎尖，用60%P VS:在25℃下装载25min，然后用100护VSZ于0℃脱水处理10一50min，换入新鲜的PVSZ，迅速投入液氮（LN）中，24h后取出于40℃水浴中化冻，立即用1.Zmol/L蔗糖的液体培养基洗涤2次，每次10min，然后用氯化三苯基四氮哇（TTC）法检测成活率，或接种于MS+6一A o.3m目1+N AA 0.02m乡飞+3%蔗糖的固体培养基上，于25℃暗培养一周转至光下培养。结果表明，地黄茎尖超低温冻存后用TTC法检测茎尖最高成活率达75%以上，植株再生率达50%，再生后的苗与对照没有形态上的变异。

全文目录

目录  4-8
缩写词表  8-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
第一章综述  14-29
  1.1 概述  14
  1.2 地黄生产中存在的问题  14-19
    1.2.1 地黄品种退化的原因  15-17
    1.2.2 地黄病毒病的危害  17
    1.2.3 防止地黄品种退化的措施  17-19
      1.2.3.1 良好的栽培管理方式  17-18
      1.2.3.2 优良品种的提纯复壮  18
      1.2.3.3 有性繁殖  18-19
      1.2.3.4 小结  19
  1.3 地黄组织培养的研究进展  19-22
    1.3.1 以根为外植体  19
    1.3.2 以茎尖和茎段为外植体  19-20
    1.3.3 以叶片为外植体  20
    1.3.4 以花粉为外植体  20
    1.3.5 小结  20-22
  1.4 地黄种质资源保存的研究  22-27
    1.4.1 药用植物种质资源保存的意义  22-23
    1.4.2 药用植物种质资源的研究  23-24
    1.4.3 植物种质资源离体保存的研究  24-27
      1.4.3.1 一般保存  24
      1.4.3.2 缓慢生长法保存  24-25
      1.4.3.3 超低温保存  25-27
  1.4 地黄种质资源保存的现状  27
  1.5 本研究的目的和意义  27-29
第二章材料与方法  29-30
  2.1 试验材料  29
  2.2 试验材料的接种与培养  29
    2.2.1 培养基及培养条件  29
    2.2.2 无菌苗的获得  29
  2.3 内源生长物质提取及检测  29
  2.4 数据处理  29-30
第三章试管地黄的诱导  30-42
  3.1 前言  30
  3.2 材料和方法  30-31
    3.2.1 材料  30
    3.2.2 培养基及培养条件  30-31
    3.2.3 无菌苗的获得和幼苗的继代培养  31
    3.2.4 幼苗的生根培养  31
    3.2.5 试管地黄诱导培养  31
  3.3 结果与分析  31-40
    3.3.1 无菌体系的建立  31
    3.3.2 试管地黄的诱导  31-40
      3.3.2.1 植物生长物质对幼苗不定根形成及膨大的影响  31-33
      3.3.2.2 蔗糖浓度对试管地黄形成的影响  33-36
      3.3.2.3 GA_3对试管地黄形成的影响  36-37
      3.3.2.4 去除顶端优势对试管地黄形成的影响  37-38
      3.3.2.5 活性炭对试管地黄诱导的作用  38-39
      3.3.2.6 光照时间对试管地黄诱导的作用  39
      3.3.2.7 培养温度对试管地黄诱导的作用  39-40
  3.4 讨论  40-42
第四章试管地黄形成过程中内源激素变化的研究  42-51
  4.1 前言  42-43
  4.2 材料和方法  43-46
    4.2.1 材料  43-44
    4.2.2 方法  44-46
      4.2.2.1 内源生长物质提取及纯化  44
      4.2.2.2 内源生长物质的测定  44-45
      4.2.2.3 数据处理  45-46
  4.3 结果与分析  46-48
    4.3.1 试管地黄不定根膨大过程中内源激素含量的变化  46-48
    4.3.2 试管地黄不定根迅速膨大时期各器官内源激素的含量  48
  4.4 讨论  48-51
第五章地黄叶片器官形态建成的研究  51-60
  5.1 前言  51-52
  5.2 材料和方法  52
    5.2.1 材料  52
    5.2.2 培养基及培养条件  52
    5.2.3 无菌苗的获得和苗的继代培养  52
    5.2.4 叶片直接再生植株和试管地黄的诱导培养  52
  5.3 结果与分析  52-58
    5.3.1 叶片直接再生不定芽  52-56
      5.3.1.1 植物生长物质种类和浓度对叶片直接再生不定芽的影响  52-54
      5.3.1.2 叶片取材位置  54-55
      5.3.1.3 光照  55-56
      5.3.1.4 背接与正接  56
    5.3.2 从叶片直接诱导试管地黄  56-58
      5.3.2.1 植物生长物质种类和浓度  56-57
      5.3.2.2 叶片取材位置  57
      5.3.2.3 光照  57-58
      5.3.2.4 背接与正接  58
  5.4 讨论  58-60
第六章地黄叶片器官形态建成中几种内源激素的变化  60-66
  6.1 前言  60-61
  6.2 材料和方法  61
    6.2.1 实验材料  61
    6.2.2 方法  61
  6.3 结果与分析  61-63
    6.3.1 地黄叶片器官形态建成中IAA含量的变化  61-62
    6.3.2 地黄叶片器官形态建成中GA_3含量的变化  62
    6.3.3 地黄叶片器官形态建成中ABA含量的变化  62-63
    6.3.4 地黄叶片器官形态建成中JA含量的变化  63
  6.4 讨论  63-66
第七章试管地黄形成过程中形态发生的研究  66-73
  7.1 前言  66
  7.2 材料和方法  66-67
    7.2.1 材料  66
    7.2.2 方法  66-67
  7.3 结果与分析  67-69
    7.3.1 试管地黄不定根初生结构的分化和早期的次生生长  67-68
      7.3.1.1 根的初生结构及其分化  67
      7.3.1.2 根早期的次生长  67-68
    7.3.2 试管地黄块根的形成发育过程及其结构  68
      7.3.2.1 试管地黄块根发育过程  68
      7.3.2.2 试管地黄成熟块根的结构  68
    7.3.2 试管地黄与自然条件下生长的地黄的结构比较  68-69
  7.4 讨论  69-73
第八章玻璃化法超低温保存地黄茎尖的研究  73-80
  8.1 前言  73-74
  8.2 材料和方法  74-75
    8.2.1 植物材料  74
    8.2.2 茎尖的预培养  74
    8.2.3 装载与脱水  74
    8.2.4 化冻、成活率检测与再生植株培养  74-75
    8.2.5 茎尖含水量测定  75
    8.2.6 可用性糖含量测定  75
  8.3 结果与分析  75-79
    8.3.1 蔗糖对预培养中茎尖含水量、可溶性糖含量和存活率的影响  75-76
    8.3.2 二甲基亚砜、乙酰胺对茎尖超低温冻存后成活率的影响  76
    8.3.3 PVS_2预处理时间对茎尖超低温冻存成活率的影响  76-77
    8.3.4 茎尖大小对超低温冷冻成活率的影响  77
    8.3.5 保存时间对茎尖存活率的影响  77-78
    8.3.6 茎尖植株的再生  78-79
  8.4 讨论  79-80
第九章讨论  80-89
  9.1 地黄试管块根的诱导与形成  80-81
  9.2 试管地黄诱导与内源激素的关系  81-83
  9.3 地黄叶片直接再生不定芽和不定根  83-84
  9.4 地黄叶片形态建成与内源激素的关系  84-85
  9.5 地黄试管块根解剖学结构  85
  9.6 地黄茎尖的超低温保存  85-87
  9.7 研究展望  87-89
参考文献  89-107
附录  107-108
致谢  108

地黄试管块根诱导及茎尖玻璃化法超低温保存

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