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褐藻胶裂合酶工程化研究与应用

作　者: 胡晓珂
导　师: 管华诗；江晓路
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: 褐藻胶裂合酶弧菌属褐藻寡糖酶法制备抗肿瘤促种子萌发原生质体中试试验
分类号: TQ920
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

褐藻胶裂合酶的研究与应用是开发新型海洋工具酶、提高海洋产品附加值的重要手段。随着海藻低聚糖的生理学活性研究的日益深入，海藻特异性酶制剂的开发和商业化也受到人们的关注。本论文以褐藻胶裂合酶的工程化为目的，利用一株具有自主知识产权的褐藻胶裂合酶高产菌株Vibrio sp．510-64为生产菌株，进行基本酶学性质和酶蛋白结构分析，确定其发酵和产酶工艺参数，为褐藻胶裂合酶制剂的工业化生产提供了充分的理论依据和实践基础。论文以从海洋环境中筛选到的一株具有褐藻胶裂合酶活性的菌株Vibrio sp．510为出发菌株，进行复合诱变和选育，获得了一株酶活力显著提高、生物学性状稳定的突变株Vibrio sp．510-64，其发酵液产酶活力从136．4EU／ml提高到了289.1EU／ml（紫外法测酶活）。实验确定Vibrio sp．510-64菌株的最佳产酶培养基为：AlgNa 5‰，NaCl 20‰，CaCl₂ 0.1‰，KH₂PO₄ 1‰，NH₄Cl 3‰，pH值为6。经过68代传代实验，未发现有菌种退化现象。液体发酵制备出褐藻胶裂合酶液，通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和两步Superdex 75凝胶过滤技术对褐藻胶裂合酶进行纯化和精制，SDS-PAGE确定此褐藻胶裂合酶的分子量为34.6kDa，采用Edman降解法测得此酶的N端氨基酸序列为AEILATDDAD，与已有的褐藻胶裂合酶N端不同，初步确定为新酶。此酶在35℃以下稳定，最适温度为35℃；在pH7～9范围内稳定，最适pH7.5，金属离子Mg²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺对酶活有促进作用；而EDTA、Ba²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Sn²⁺则对该酶的活力有抑制作用。用EDTA完全抑制酶活后，发现Ca²⁺、Mg²⁺和Sn²⁺对此酶有不同程度的复活作用，推测这些离子是酶活力必需的离子。确定了应用此酶酶解裙带菜分离、制备原生质体的最佳酶解条件为28℃，时间为2h；酶量为213.36EU／0.5g藻体；NaCl浓度为50‰；转速为150rpm。在此条件下，每0.5g藻体的原生质体产量可达2.62±0.09×10⁶个。酶解过程可被不同褐藻胶裂合酶工程化研究与应用浓度的reZ+，MnZ+（0.05，0.05，o一oM）激活，可被eaZ+完全抑制。酶解褐藻寡糖及其磺化衍生物的体内抗实体瘤5180和体外tsFTZ10细胞毒实验显示:重均分子量3798Da，磺化度1 .3，剂量100和50m叭g时，褐藻寡糖A显示出较高抑瘤作用，抑瘤率可达65.98和70.38%。流式细胞仪测定的褐藻寡糖及其衍生物对tsFTZ10细胞的细胞毒作用显示出这些寡糖没有细胞毒作用，推测寡糖抗肿瘤作用是通过调节宿主细胞介导的免疫应答而间接发挥抗肿瘤作用。重均分子量为1445Da的褐藻寡糖混合物在一定的剂量范围（0.5¹.25%o）内可以提高种子活力，促进玉米种子的萌发，增加芽和根的长度，提高种子内部淀粉酶的活力，其中，浸种浓度为0.75喻的褐藻寡糖组显示了最高的促进萌发和提高淀粉酶活力的作用。中试试验最终确定了发酵控制参数，显示vibrio sP.5 10一64是一株发酵周期短、产酶性能稳定、发酵条件易于控制、成本低廉的优良菌种，适合工业化生产。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
1 绪论  10-46
  1.1 立题目的及意义  10-11
  1.2 褐藻胶及分子基础  11-12
  1.3 褐藻胶的降解  12-13
  1.4 褐藻胶裂合酶研究进展  13-32
    1.4.1 褐藻胶裂合酶的作用机制及分类  13-14
    1.4.2 褐藻胶裂合酶的来源及研究现状  14-29
    1.4.3 褐藻胶裂合酶的结构与功能的关系  29-30
    1.4.4 褐藻胶裂合酶的分离、纯化的一般方法  30-31
    1.4.5 褐藻胶裂合酶的基因工程研究进展  31-32
  1.5 褐藻胶裂合酶的应用  32
  1.6 褐藻胶酶解产物的生物活性及应用  32-34
  1.7 褐藻胶裂合酶应用的前景展望  34-46
2 菌种的诱变选育与产酶条件的优化  46-70
  2.1 褐藻胶降解菌株Vibrio sp.510-64的诱变选育  46-54
    2.1.1 材料和方法  46-47
    2.1.2 原始菌株的处理  47-48
    2.1.3 酶活力的测定  48
    2.1.4 菌种的诱变  48-49
    2.1.5 结果与讨论  49-54
  2.2 Vibrio sp.510-64生长条件优化实验  54-66
    2.2.1 材料和方法  54-57
    2.2.2 结果与分析  57-66
  2.3 讨论  66-67
  2.4 本章小结  67-70
3 Vibriosp.510-64菌株的褐藻胶裂合酶分离纯化及酶学性质研究  70-96
  3.1 材料和方法  71-76
    3.1.1 原料  71
    3.1.2 褐藻胶裂合酶的活性检测  71
    3.1.3 蛋白质含量的测定  71-72
    3.1.4 细菌培养  72
    3.1.5 蛋白质的分离纯化  72-73
    3.1.6 蛋白质电泳  73-74
    3.1.7 PVDF印迹转移  74
    3.1.8 蛋白质N端氨基酸序列测定  74
    3.1.9 褐藻胶裂合酶内切酶活性的确定  74
    3.1.10 褐藻胶裂合酶的底物专一性分析  74-75
    3.1.11 褐藻胶裂合酶的基本酶学性质测定  75-76
  3.2 结果与讨论  76-91
    3.2.1 褐藻胶裂合酶的纯化结果  76-79
    3.2.2 蛋白质N端氨基酸序列的测定  79-85
    3.2.3 褐藻胶裂合酶内切型活性测定结果  85
    3.2.4 褐藻胶裂合酶底物专一性分析  85-87
    3.2.5 褐藻胶裂合酶的基本酶学性质测定  87-91
  3.3 讨论  91-93
  3.4 本章小结  93-96
4 褐藻胶裂合酶的应用  96-110
  4.1 褐藻胶裂合酶用于从裙带菜(Undaria pinnatifida)中分离原生质体  96-110
    4.1.1 材料和方法  97-99
    4.1.2 结果与分析  99-106
    4.1.3 讨论  106
    4.1.4 本章小结  106-110
5 褐藻寡糖生物学活性的初步研究  110-142
  5.1 褐藻寡糖的抗肿瘤活性  110-127
    5.1.1 材料与方法  111-116
    5.1.2 结果与分析  116-124
    5.1.3 讨论  124-126
    5.1.4 本节小结  126-127
  5.2 褐藻寡糖促进种子萌发作用  127-142
    5.2.1 材料和方法  127-131
    5.2.2 结果与分析  131-136
    5.2.3 讨论  136-138
    5.2.4 本节小结  138-142
6 褐藻胶裂合酶工程化研究  142-154
  6.1 褐藻胶裂合酶及其酶解产物的制备工艺  142-145
    6.1.1 材料及设备  142
    6.1.2 发酵工艺  142-144
    6.1.3 褐藻胶裂合酶的工业化制备工艺  144
    6.1.4 酶解褐藻胶制备寡糖终产物的MALDI-TOF-MS质谱分析  144-145
    6.1.5 酶解褐藻胶制备寡糖终产物的紫外和还原糖法分析  145
  6.2 结果与分析  145-148
  6.3 讨论  148-149
  6.4 本章小结  149
  6.5 设计的工艺路线  149-154
论文总结  154-158
后期工作设想  158-160
博士论文工作期间发表论文的情况  160-162
致谢  162

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