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短季棉衰老的激素变化及衰老相关基因的克隆

作　者: 沈法富
导　师: 喻树迅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 短季棉衰老激素半胱氨酸蛋白酶蔗糖合成酶
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 353次
引　用: 12次
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内容摘要

棉花叶片的早衰影响棉花的产量，导致棉花纤维强度降低、纤维长度变短、纤维整齐度下降，从而降低棉纤维的成纱质量，因此，从生理生化、基因的表达和调节控制水平上揭示棉花的早衰机制，对提高棉花产量，改善棉花纤维品质具有重要的意义。（1）以陆地棉品种辽棉9号的去根幼苗为材料，对其进行暗诱导衰老培养，在培养液中分别加入6-BA、ABA、GSH、H₂O₂、CaCL₂、A23187和A23187与CaCL₂，测定在不同培养条件下棉花去根幼苗叶片内源激素、SOD酶活性和MDA含量的变化，结果表明：棉花叶片衰老的可能过程首先是细胞分裂素含量的下降，ABA含量的上升。6-BA、GSH和钙离子均延缓叶片的衰老，ABA和H₂O₂促进叶片的衰老。（2）以3个生育和衰老特性不同的短季棉品种作材料，测定它们在生育进程中主茎叶内源激素含量的动态变化，结果表明：短季棉的早熟性与主茎叶早期吲哚乙酸（IAA）和玉米素及其核苷（Z+ZR）含量出现高峰值的时间相一致，这两种激素高峰值出现的时间愈早，其产量器官发育也早；短季棉的早衰性与主茎叶后期脱落酸（ABA）、乙烯和IAA出现的高峰时间相一致，而与主茎叶异戊烯基嘌呤及其核苷（iP+iPA）含量相反，短季棉始絮后，主茎叶iP+iPA含量低、ABA、IAA和乙烯含量高的品种易早衰，主茎叶iP+iPA含量高、ABA、IAA和乙烯含量低的品种抗早衰。（3）以辽棉9号衰老叶片的cDNA为模板，利用RACE技术，克隆了棉花Ghcysp基因，注册号为AY604196。基因序列的长度为1368bp，包含一个1034bp的开放阅读框，起始于序列的99位，终止于1133位，编码344个氨基酸。在棉花基因组中，Ghcysp基因是两个拷贝。Ghcysp蛋白质与其它植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为67％—82％。Ghcysp基因编码蛋白质的分子量为37.88 KD，等电点为4.80。该蛋白质具有半胱氨酸、组氨酸和天冬氨基酸三个活性催化反应中心，是一个跨膜蛋白质，位于液胞膜上。（4）基因表达分析表明：在棉花的根、下胚轴、花、胚珠和幼叶中，Ghcysp基因不表达，在棉花的衰老叶片中Ghcysp基因表达。细胞分裂素和蔗糖处理，可以抑制Ghcysp基因的表达，IAA处理的初期，抑制Ghcysp基因的表达，后期Ghcysp基因的表达量恢复到处理前，ABA和双氧水处理，增加叶片Ghcysp基因的表达量。ABA、双氧水和黑暗处理未进入衰老叶片，不能增加的Ghcysp基因的转录，这说明棉花Ghcysp基因是叶片自然衰老特异表达的基因。（5）比较中棉所10号和中棉所36上部与中部棉铃纤维发育蔗糖合成酶（SuSy）活性和与mRNA转录的差异，结果发现，在棉花纤维发育的初期，胚珠SuSy酶活性和mRNA转录的下降，导致棉花铃重的下降，开花2-3天后，其胚珠表皮细胞突起SuSy酶活性与mRNA转录量下降，可导致纤维长度的下降、短绒增加。花后18-27天，蔗糖合成酶的活性和mRNA转录下降，影响棉花纤维的强度和伸长率。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-11
主要符号表  11-12
第一章文献综述  12-28
  1.1 植物衰老的细胞形态、生理生化变化  12-19
    1.1.1 植物衰老的细胞结构变化  12-15
    1.1.2 植物衰老的物质代谢变化  15-17
    1.1.3 植物衰老的激素变化  17-19
  1.2 植物衰老过程中的编程性细胞死亡  19-24
    1.2.1 植物衰老的基因调控  19-20
    1.2.2 植物衰老的细胞程序性死亡  20-21
    1.2.3 植物衰老与细胞程序性死亡的区别和联系  21-22
    1.2.4 植物衰老过程中细胞程序性死亡的可能机制  22-24
  1.3 影响植物衰老的环境因素  24-26
    1.3.1 生物学因素  25
    1.3.2 非生物学因素  25-26
  1.4 植物衰老的调控  26
    1.4.1 衰老的可塑性及基因调控  26
    1.4.2 衰老的内源激素调节  26
    1.4.3 衰老的器官相关性调节  26
  1.5 植物衰老研究的展望  26-27
  1.6 研究的目的和意义  27-28
第二章棉花叶片衰老过程中激素和膜脂过氧化的关系  28-33
  2.1 材料与方法  28-29
    2.1.1 材料的培养  28-29
    2.1.2 叶绿素含量的测定  29
    2.1.3 可溶性蛋白质含量  29
    2.1.4 细胞分裂素和脱落酸的测定  29
    2.1.5 SOD酶活性的测定  29
    2.1.6 MDA含量的测定  29
    2.1.7 数据的处理  29
  2.2 结果与分析  29-32
    2.2.1 暗诱导棉花叶片叶绿素和可溶性蛋白质含量的变化  29-30
    2.2.2 暗诱导棉花叶片内源激素、SOD酶活性和MDA含量变化  30
    2.2.3 外源激素对棉花衰老的影响  30
    2.2.4 还原谷胱苷肽和双氧水对棉花衰老的影响  30-31
    2.2.5 C_a~(2+)和A23187对棉花叶片衰老的影响  31-32
  2.3 讨论  32-33
第三章不同短季棉品种生育进程中主茎叶内源激素的变化  33-40
  3.1 材料与方法  33-34
    3.1.1 材料的种植  33
    3.1.2 测定方法  33-34
    3.1.3 衰老指标调查  34
    3.1.4 数据处理  34
  3.2 结果与分析  34-38
    3.2.1 不同品种生育和衰老特性的差异  34-35
    3.2.2 棉花主茎叶生长素含量的变化  35-36
    3.2.3 棉花主茎叶细胞分裂素含量的变化  36
    3.2.4 棉花主茎叶ABA含量的变化  36-37
    3.2.5 棉花主茎叶乙烯释放量的变化  37-38
  3.3 讨论  38-40
第四章棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表达分析  40-67
  4.1 材料与方法  40-52
    4.1.1 实验材料  40-42
    4.1.2 实验方法  42-52
      4.1.2.1 总RNA的提取  42
      4.1.2.2 反转录  42-43
      4.1.2.3 目的基因的分离  43-48
      4.1.2.4 Southern杂交分析  48
      4.1.2.5 基因的表达分析  48-51
      4.1.2.6 RT-PCR结合Northern杂交分析  51
      4.1.2.7 棉花叶片外源激素、蔗糖和双氧水的培养  51
      4.1.2.8 序列的生物信息学分析  51-52
  4.2 结果与分析  52-64
    4.2.1 棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和序列分析  52-55
    4.2.2 Ghcysp基因的同源性和系统进化分析  55-56
    4.2.3 Ghcysp蛋白质特性和结构的生物信息学分析  56-61
      4.2.3.1 Ghcysp蛋白质的特性预测  56-58
      4.2.3.2 Ghcysp蛋白质高级结构的预测  58-60
      4.2.3.3 Ghcysp基因的氨基酸跨膜区段预测  60-61
    4.2.4 Ghcysp基因的Southern杂交  61
    4.2.5 Ghcysp基因的时、空表达特点分析  61-62
    4.2.6 外源激素、蔗糖和双氧水对Ghcysp基因表达的影响  62-64
  4.3 讨论  64-67
    4.3.1 Ghcysp基因的克隆和分析  64-65
    4.3.2 Ghcysp蛋白酶与细胞程序性死亡  65-66
    4.3.3 Ghcysp基因的表达特点  66-67
第五章不同衰老特性短季棉纤维蔗糖合成酶的差异比较  67-75
  5.1 材料与方法  68-69
    5.1.1 材料  68
    5.1.2 方法  68-69
      5.1.2.1 材料的种植  68-69
      5.1.2.2 蔗糖合成酶活性的测定  69
      5.1.2.3 RNA的提取  69
      5.1.2.4 RNA的反转录  69
      5.1.2.5 蔗糖合成酶3‘-RACE cDNA片段的扩增、克隆和序列测定  69
      5.1.2.6 RT-PCR结合Northern分析  69
  5.2 结果与分析  69-72
    5.2.1 中部和上部棉铃纤维品质的差异  70
    5.2.2 棉纤维发育进程中蔗糖合成酶活性的变化  70-71
    5.2.3 蔗糖合成酶cDNA的3‘-UTR序列比较  71-72
    5.2.4 棉纤维发育进程中蔗糖合成酶转录水平的变化  72
  5.3 讨论  72-75
    5.3.1 SuSy酶在棉纤维细胞分化中的作用  72-73
    5.3.2 棉纤维发育过程中的SuSy酶作用的生化基础  73
    5.3.3 SuSy酶与棉纤维细胞壁的合成  73-75
第六章结论与讨论  75-78
参考文献  78-90
附录  90-106
致谢  106-107
作者简历  107

短季棉衰老的激素变化及衰老相关基因的克隆

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