学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立及CBF耐逆相关基因的导入

作　者: 吴关庭
导　师: 夏英武；陈锦清
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 高羊茅 胚性愈伤组织 农杆菌 遗传转化 CBF1基因 耐逆性
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 396次
引　用: 9次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


高羊茅是目前正在国内外广泛应用的主要冷季型草坪草之一，利用基因工程技术改良其耐逆性对保持草坪四季常绿，节约水资源，扩大建植区域，尤其是对改善我国西部地区的生态环境具有十分重要的意义。本论文在对高羊茅胚性愈伤组织植株再生与农杆菌介导遗传转化的多种影响因素进行系统研究的基础上，将组成型表达启动子CaMV 35S引导的耐逆相关CBF1基因导入该草种的基因组，获得耐逆性增强的转基因植株。主要研究结果如下： （1）通过对成熟种子愈伤组织诱导、胚性愈伤组织继代发生和分化的多种影响因素的研究，建立了高羊茅胚性愈伤组织植株再生体系。研究表明，高羊茅成熟种子愈伤组织诱导需要较高浓度的2，4-D，以8mg／L 2，4-D与2mg／L ABA配合能获得最佳的诱导效果；种子灭菌后纵切或切胚，可使出愈率成倍提高；采用MS基本培养基和在培养基中添加0.5g／L的水解酪蛋白与谷氨酰胺也有助于提高出愈率；低剂量（10Gy）γ射线辐照处理对成熟种子愈伤组织尤其是胚性愈伤组织形成有一定的刺激效应。在继代培养基中添加0.1～0.2mg／L BAP或2.5mg／L硫酸铜，或将继代培养基中蔗糖浓度提高到60g／L能促进胚性愈伤组织发生，提高胚性愈伤组织频率。高羊茅胚性愈伤组织分化时，BAP的作用要比KT大，但2mg／L BAP与0.5mg／L KT配合可获得更佳的效果；在该细胞分裂素水平下，生长素NAA用0.5mg／L，愈伤组织再生率最高；胚性愈伤组织先在含60g／L蔗糖的分化培养基上高渗预分化，以及经高渗预分化后的致密愈伤组织在琼脂浓度为10g／L的分化培养基上分化，能明显促进愈伤组织的植株再生；在分化培养基中添加脯氨酸导致愈伤组织再生率下降，但同时有减少白化苗再生的趋势。试验还发现，高羊茅成熟种子愈伤组织诱导特别是胚性愈伤组织发生及植株再生存在明显的品种间差异，说明对品种进行选择是必要的。 （2）以gus基因瞬时表达频率为指标，研究确定农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为：预培养培养基中添加较高浓度（0.5mg／L）的BAP和NAA，预培养时间3～5d；农杆菌悬浮液OD600值0.5～0.7，感染时间10～20min；共培养基pH值5.2～5.6，共培养温度23～25℃，共培养时间3d；农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中均添加100μmol／L的乙酰丁香酮。试验表明，在农杆菌介导高羊茅遗传转化中，抑菌剂宜选用梭节青霉素;以潮霉素作为选择剂时，采用低浓度（50一15om留L）连续筛选的方式比较合适，在该方式下，获得的转基因植株较多。通过以上研究，建立起了农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织遗传转化体系。 （3）采用所建立的农杆菌介导转化体系在世界上首次将耐逆相关CBFI基因导入4个供试高羊茅品种的基因组，经PCR检测、GUS组织化学染色、离体叶片潮霉素抗性鉴定和Sotlthem杂交分析，共获得112株独立来源的转基因植株，平均转化频率为1.7%（按GUS+愈伤组织数计算）和1.9%（按再生转基因植株数计算），但不同品种间存在明显差异。 （4）整株存活试验表明，在相同的高盐与高渗胁迫下，转基因植株具有明显的生长优势，植株存活率分别达65.7%和71.4%，高于非转化对照植株的28.6%和42.9%。经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率测定结果显示，转基因植株的相对电导率平均较非转化对照植株低20%一30%。这些事实说明，CBFI基因的组成型表达使高羊茅转基因植株的耐逆性得到了增强。考察表明，在正常环境条件下，转基因植株的生长受到了一定抑制。对1个Tl代转基因株系进行PCR检测后发现，外源基因已传递至后代，但发生了严重的偏分离。 （5）作为本论文的相关研究内容，从高羊茅基因组中克隆出1个608bP的C刀尸同源基因片段，该片段与3个拟南芥 CBF基因的核昔酸及其推导氨基酸序列分别具有81%一84%和75%一79%的同源性，而且推导氨基酸序列中包含有同源性更高的APZ DNA结合域以及为CBF蛋白独有的两段特征序列PKK/RRAGRxKFxETRHP和DSAWR。

全文目录


本论文研究的创新性  12-13
摘要(中文)  13-15
摘要(英文)  15-17
主要缩略语  17-18
表格一览表  18-20
图一览表  20-21
第一章 文献综述  21-60
  1.1 农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展  21-33
    1.1.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机理  21-24
    1.1.2 农杆菌介导的遗传转化特点  24-25
    1.1.3 农杆菌介导单子叶植物遗传转化进展  25-27
    1.1.4 农杆菌介导单子叶植物遗传转化的影响因素  27-31
      1.1.4.1 植物基因型  27-28
      1.1.4.2 外植体  28
      1.1.4.3 农杆菌菌株的选择与质粒的构建  28-29
      1.1.4.4 启动子的优化  29
      1.1.4.5 vir基因的活化  29-30
      1.1.4.6 农杆菌菌液浓度和共培养技术条件  30-31
    1.1.5 农杆菌介导单子叶植物遗传转化的发展策略  31-33
      1.1.5.1 农杆菌介导法与基因枪法相结合  31
      1.1.5.2 构建超毒质粒载体和农感染型质粒  31
      1.1.5.3 不依赖于诱导物的vir基因高效活化  31-32
      1.1.5.4 受体材料预创伤处理  32
      1.1.5.5 介导转移大片段DNA  32-33
  1.2 高羊茅和其它羊茅植株再生与遗传转化研究进展  33-44
    1.2.1 植株再生体系的建立  34-37
      1.2.1.1 由胚性愈伤组织再生植株  34-35
      1.2.1.2 由胚性悬浮培养物再生植株  35
      1.2.1.3 由原生质体再生植株  35-36
      1.2.1.4 由高频再生组织再生植株  36-37
      1.2.1.5 由花药-幼穗培养再生单倍体植株  37
    1.2.2 胚性培养物的长期保存  37-39
      1.2.2.1 继代保存  37-38
      1.2.2.2 低温保存  38-39
    1.2.3 外源基因的遗传转化  39-42
      1.2.3.1 遗传转化概况  39-41
      1.2.3.2 遗传转化影响因素  41-42
    1.2.4 植株再生与遗传转化中存在的主要问题  42-44
      1.2.4.1 胚性愈伤组织诱导频率低  42-43
      1.2.4.2 再生植株白化现象比较严重  43
      1.2.4.3 转基因后代的获得相对比较困难  43-44
  1.3 CBF转录激活因子及其在提高植物耐逆性中的作用  44-57
    1.3.1 CBF基因的分离与鉴定  45-47
    1.3.2 CBF转录激活因子的表达  47-51
    1.3.3 CBF转录激活因子的结构特点与特性  51-52
    1.3.4 CBF转录激活因子的生理生化功能  52-54
    1.3.5 CBF转录激活因子在提高植物耐逆性中的作用  54-56
    1.3.6 CBF转录激活因子的应用展望  56-57
  1.4 本论文研究的目的意义和主要内容  57-60
    1.4.1 目的意义  57-59
    1.4.2 主要内容  59-60
第二章 高羊茅胚性愈伤组织植株再生体系的建立  60-86
  2.1 材料和方法  61-64
    2.1.1 材料  61
    2.1.2 方法  61-64
      2.1.2.1 愈伤组织诱导及其影响因素  61-62
      2.1.2.2 愈伤组织继代改造及其影响因素  62-63
      2.1.2.3 胚性愈伤组织分化及其影响因素  63-64
  2.2 结果与分析  64-81
    2.2.1 不同因素对成熟种子愈伤组织诱导的影响  64-71
      2.2.1.1 2,4-D与ABA配合  64
      2.2.1.2 BAP添加  64-66
      2.2.1.3 有机物添加  66-67
      2.2.1.4 基本培养基类型  67
      2.2.1.5 种子切割方式  67-68
      2.2.1.6 辐照处理  68-71
    2.2.2 不同因素对愈伤组织继代改造的影响  71-76
      2.2.2.1 BAP添加  71-73
      2.2.2.2 硫酸铜添加  73
      2.2.2.3 提高蔗糖浓度  73-76
    2.2.3 不同因素对胚性愈伤组织分化的影响  76-81
      2.2.3.1 BAP与KT配比  76
      2.2.3.2 NAA浓度  76-78
      2.2.3.3 脯氨酸添加  78-79
      2.2.3.4 高渗预分化  79-81
      2.2.3.5 琼脂浓度  81
  2.3 讨论  81-86
    2.3.1 高羊茅胚性愈伤组织植株再生的影响因素  81-84
    2.3.2 高羊茅成熟种子组织培养的品种间差异  84
    2.3.3 减轻高羊茅再生植株白化现象的关键环节  84-86
第三章 农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立  86-108
  3.1 材料和方法  87-91
    3.1.1 材料  87
      3.1.1.1 植物材料  87
      3.1.1.2 农杆菌菌株与质粒  87
      3.1.1.3 抗生素、筛选剂和其它重要试剂  87
    3.1.2 方法  87-91
      3.1.2.1 确定适宜抗生素种类及其浓度试验  87-88
      3.1.2.2 农杆菌介导转化影响因素试验  88-89
      3.1.2.3 高羊茅对潮霉素的内源抗性试验  89-90
      3.1.2.4 不同浓度潮霉素筛选效果试验  90-91
  3.2 结果与分析  91-105
    3.2.1 抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长和分化的影响  91-95
    3.2.2 多种因素对农杆菌介导高羊茅愈伤组织转化效率的影响  95-101
      3.2.2.1 预培养培养基  95-96
      3.2.2.2 预培养时间  96-97
      3.2.2.3 菌液浓度  97-98
      3.2.2.4 感染时间  98
      3.2.2.5 乙酰丁香酮浓度  98-99
      3.2.2.6 乙酰丁香酮添加方式  99-100
      3.2.2.7 共培养基pH值  100-101
      3.2.2.8 共培养温度  101
      3.2.2.9 共培养时间  101
    3.2.3 不同浓度潮霉素的筛选效果  101-105
      3.2.3.1 高羊茅胚性愈伤组织对潮霉素的内源抗性  101-103
      3.2.3.2 不同浓度潮霉素筛选对高羊茅转化效率的影响  103-105
  3.3 讨论  105-108
    3.3.1 适用于农杆菌介导高羊茅遗传转化的抑菌抗生素  105
    3.3.2 影响农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的主要因素  105-107
    3.3.3 农杆菌介导高羊茅遗传转化中合适的潮霉素筛选方式  107
    3.3.4 农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的品种间差异  107-108
第四章 转基因植株的获得与分子鉴定  108-122
  4.1 材料和方法  108-114
    4.1.1 材料  108
      4.1.1.1 植物材料  108
      4.1.1.2 菌株与质粒  108
      4.1.1.3 重要试剂  108
    4.1.2 方法  108-114
      4.1.2.1 农杆菌介导转化及抗性愈伤组织的筛选与再生  108-109
      4.1.2.2 高羊茅基因组DNA提取  109-110
      4.1.2.3 hpt基因和gus基因的PCR检测  110-111
      4.1.2.4 GUS组织化学染色  111
      4.1.2.5 离体叶片潮霉素抗性鉴定  111-112
      4.1.2.6 Southern杂交  112-114
  4.2 结果与分析  114-120
    4.2.1 高羊茅转基因植株的获得  114-116
    4.2.2 转基因植株的PCR检测  116
    4.2.3 转基因植株的GUS活性分析  116-118
    4.2.4 转基因植株的离体叶片潮霉素抗性鉴定  118-119
    4.2.5 转基因植株的Southern杂交分析  119-120
  4.3 讨论  120-122
第五章 转基因植株的表型鉴定及遗传分析  122-130
  5.1 材料和方法  123-125
    5.1.1 材料  123
      5.1.1.1 植物材料  123
      5.1.1.2 主要试剂  123
    5.1.2 方法  123-125
      5.1.2.1 高盐与高渗胁迫下整株存活试验  123
      5.1.2.2 不同逆境胁迫处理后叶片相对电导率测定  123-124
      5.1.2.3 转基因植株形态与生长特征考察  124
      5.1.2.4 T_1代转基因PCR检测  124-125
  5.2 结果与分析  125-128
    5.2.1 转基因植株的耐逆性表现  125-128
      5.2.1.1 高盐胁迫对转基因植株存活与生长的影响  125-126
      5.2.1.2 高渗胁迫对转基因植株存活与生长的影响  126-127
      5.2.1.3 不同逆境胁迫处理后叶片相对电导率变化  127-128
    5.2.2 转基因植株的形态与生长特征  128
    5.2.3 T_1代中转基因的分离  128
  5.3 讨论  128-130
第六章 高羊茅CBF转录激活因子基因片段的克隆  130-135
  6.1 材料和方法  131-132
    6.1.1 材料  131
      6.1.1.1 植物材料  131
      6.1.1.2 质粒和菌株  131
      6.1.1.3 引物和试剂  131
    6.1.2 方法  131-132
      6.1.2.1 基因组DNA提取  131
      6.1.2.2 PCR扩增  131
      6.1.2.3 DNA片段重组入质粒载体  131-132
      6.1.2.4 DNA序列测定及分析  132
  6.2 结果与分析  132-134
    6.2.1 PCR产物的扩增和克隆  132-133
    6.2.2 基因序列与同源性分析  133-134
  6.3 讨论  134-135
参考文献  135-153
附录 攻读博士学位期间从事科研工作情况及取得的主要业绩  153-154

相似论文

  1. 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
  2. rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究,S668.4
  3. 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
  4. 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
  5. 水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建,S435.111.42
  6. 大豆细菌性斑点病原物的分离鉴定及其两个Ⅲ型效应因子的克隆与功能研究,S435.651
  7. 新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建,S512.1
  8. 农杆菌介导GmWRKY21基因转化大豆的研究,S565.1
  9. 大豆GmFtsH基因的遗传转化及功能分析,S565.1
  10. 野生种马铃薯蛋白酶抑制剂基因CYS和API的克隆及SpCYS转化马铃薯和烟草的初步研究,S532
  11. 小麦遗传转化体系建立和优化及抗坏血酸过氧化物酶基因（Ta-APX）转化小麦研究,S512.1
  12. 蝴蝶兰花序分生组织基因LFY表达载体构建及对蝴蝶兰的遗传转化,S682.31
  13. 切花菊转DdICE1基因研究,S682.11
  14. 氮素对高羊茅耐寒性生理机制研究,S688.4
  15. 切花菊蚜虫抗性鉴定与机理探讨及LLA转基因研究,S682.11
  16. 枣叶片再生途径的组织学研究及影响遗传转化因素的分析,S665.1
  17. 转attM基因彩色马蹄莲及AttM解酯酶抗体制备研究,S682.264
  18. ‘突尼斯软籽’石榴再生体系和GFP报告基因的瞬时表达研究初报,S665.4
  19. 农杆菌介导的菜心遗传转化研究,S634.5
  20. 野生茄子托鲁巴姆黄萎病抗性相关基因StPGIP功能鉴定,S572
  21. 3GT基因转化马铃薯的研究,S532

中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
© 2012 www.xueweilunwen.com