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人载脂蛋白H与磷脂膜的相互作用及其膜结合态构象的研究

作　者: 王少雄
导　师: 隋森芳
学　校: 清华大学
专　业: 生物物理学
关键词: 人载脂蛋白H（ApoH） 气／液界面脂单层膜 脂质体 膜脂-蛋白相互作用 插膜
分类号: Q591.2
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要


载脂蛋白 H（apolipoproteinH，简称ApoH）是一种属于载脂蛋白家族的血浆 糖蛋白。目前为止，ApoH的生物学功能并不十分清楚。由于ApoH在体内的 很多生理和病理功能都与它和磷脂膜的相互作用有关，而目前这方面的研究成 果还很少。因此，研究ApoH与脂膜的相互作用及其在膜表面的结构将具有十 分重要的生物学意义和潜在的应用前景。 本文应用单层膜、脂质体以及含有甲醇的有机溶剂体系等模型系统对ApoH 与磷脂膜的相互作用及其膜结合态的构象进行了深入的研究。 首先，我们利用气／液界面脂单层膜的方法在国际上首次证明了ApoH分子 具有较强的两亲性，能够插入带负电荷的磷脂膜内，蛋白的插膜深度约为2±1 A。ApoH的插膜的作用力来自膜脂一蛋白之间的静电作用和疏水作用。 其次，我们应用荧光光谱和圆二色光谱等实验技术研究了与脂质体相结合 的ApoH的构象。实验结果显示当结合到带负电荷的脂质体表面之后，ApoH 分子的二级结构将发生显著变化，蛋白分子被诱导产生出一定比例的α-螺旋 结构成分。通过改变脂质体中磷脂的组成和缓冲液中的离子强度等条件，我们 首次发现膜结合状态的ApoH分子具有两种不同的构象。在低离子强度条件 下，蛋白分子中大部分色氨酸残基吸附于脂膜表面，少部分插入磷脂膜内；随 着体系离子强度的提高，蛋白分子中非插膜的色氨酸残基将首先从脂膜表面脱 附，而插膜片段的脱附要显著滞后。ApoH分子在膜表面的构象变化为其在体 内发挥标记并免疫清除血浆中带负电荷的脂质体，以及在抗磷脂综合症等自身 免疫疾病中的生物学功能提供了重要的结构基础。 第三，我们应用含有一定浓度甲醇的缓冲液模拟膜一水界面区域的微环 境，对ApoH分子的插膜与其膜结合态构象之间的相互关系作了进一步的研 究。在含57％左右甲醇的溶液中ApoH能被诱导产生出与其在负电荷磷脂膜表 面几乎相同的构象；同时经该有机溶剂体系处理后，构象发生变化的ApoH分 子的插膜能力也相应增强。经毛细管电泳技术检测，这时有更多的蛋白质分子吸附于脂膜表面区域。以上实验说明在ApoH与磷脂膜作用的过程中，蛋白的插膜与其特定的膜结合态构象密切相关。 综上，本文揭示了ApoH与磷脂膜相互作用的分子机制，并建立了一个有关ApoH插膜过程及在膜表面发生构象变化的模型。ApoH首先通过与负电荷磷脂之间的静电引力富集于脂膜表面区域。接着，受该区域微观物理化学环境（主要是介电常数和pH值条件）的影响，吸附于膜脂界面的ApoH将发生特定的构象变化，同时蛋白分子的一部分插入到脂膜内部。最后，插膜的ApoH分于将在膜脂界面发生进一步的构象调整井最终稳定于膜脂界面。有关ApoH插膜的模型具有一般性的生物学意义，它的建立为深入研究膜外周蛋白与磷脂膜的相互作用提供了重要的信息。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
目 录  7-10
缩 略 语  10-11
第1章 文献综述  11-25
  1．1 ApoH及其分子结构简介  11-19
    1．1．1 ApoH概述  11
    1．1．2 ApoH的基因结构  11-14
    1．1．3 ApoH的蛋白结构  14-17
    1．1．4 ApoH的遗传多型性  17-19
  1．2 ApoH的主要生理和病理功能  19-21
    1．2．1 ApoH的主要生理功育  19
    1．2．2 与ApoH有关的的一些病理现象  19-20
    1．2．3 ApoH与自身免疫疾病  20-21
  1．3 ApoH与磷脂膜作用的研究现状  21-23
    1．3．1 ApoH与支撑膜的相互作用  21-22
    1．3．2 ApoH与磷脂脂质体的相互作用  22-23
  1．4 本论文的研究工作  23-25
第2章 ApoH的分离纯化及表征  25-43
  2．1 ApoH的分离纯化  25-31
    2．1．1 仪器与材料  25-26
    2．1．2 实验步骤  26-27
    2．1．3 实验结果  27-31
  2．2 毛细管电泳方法测定ApoH的分子量  31-37
    2．2．1 仪器与材料  31
    2．2．2 实验结果  31-37
  2．3 毛细管电泳方法狈定ApoH的等电点  37-43
    2．3．1 仪器与材料  37-38
    2．3．2 实验结果  38-43
第3章 ApoH与气／腋界面脂单层膜的相互作用  43-77
  3．1 单分子层实验模型  44-48
    3．1．1 单分子层实验装置简介  44-45
    3．1．2 气／液界面脂单分子层实验方法  45-46
    3．1．3 实验材料与实验步骤  46-48
  3．2 ApoH自发成膜性质的研究  48-51
    3．2．1 材料与方法  48
    3．2．2 ApoH的自发成膜  48-49
    3．2．3 气／液界面ApoH分子面积的测定  49-51
  3．3 ApoH插入气／液界面脂单层膜的研究  51-66
    3．3．1 ApoH插膜的π-t曲线  52-53
    3．3．2 ApoH插膜对磷脂组成和状态的选择性  53-58
    3．3．3 亚相pH值和离子强度条件对ApoH插膜的影响  58-64
    3．3．4 不同修饰状态的ApoH与磷脂膜作用的比较  64-66
  3．4 实验结果讨论  66-77
第4章 ApoH与脂质体的相互作用  77-94
  4．1 材料与方法  77-80
  4．2 实验结果  80-92
    4．2．1 ApoH的内源荧光光谱测定  80-82
    4．2．2 磷脂组份对ApoH与脂质体作用的影响  82-84
    4．2．3 环境温度对ApoH与脂质体作用的影响  84
    4．2．4 荧光能量转移方法研究ApoH与脂质体的相互作用  84-87
    4．2．5 疏水性自旋探针5-、7-、12-Doxyl-PC荧光淬灭实验  87-90
    4．2．6 不同修饰状态的ApoH与脂质体的相互作用  90-92
  4．3 讨论  92-94
第5章 膜结合态ApoH构象的研究  94-110
  5．1 材料与方法  94-96
  5．2 实验结果  96-107
    5．2．1 ApoH与脂质体作用的CD光谱研究  96-97
    5．2．2 pH值条件对ApoH结构的影响  97-99
    5．2．3 Ca~（2+）存在条件下ApoH与PG/PC脂质体的结合  99-100
    5．2．4 亚相离子对膜结合态ApoH的脱附  100-103
    5．2．5 碘离子和丙烯酰胺淬灭法研究ApoH与脂质体的相互作用  103-107
  5．3 讨论  107-110
第6章 ApoH在膜表面的构象与其插膜能力的关系  110-124
  6．1 材料与方法  110-111
  6．2 实验结果  111-122
    6．2．1 脂单层膜方法研究ApoH的插膜  111-113
    6．2．2 ApoH在甲醇／水混合溶剂中的CD光谱  113-116
    6．2．3 经甲醇处理后的ApoH插入DMPC单层膜的研究  116-117
    6．2．4 毛细管电泳方法测定ApoH的界面浓度  117-122
  6．3 讨论  122-124
论文总结  124-126
参考文献  126-140
博士期间发表的学术论文  140-143
致 谢  143

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 物质代谢及能量代谢 > 蛋白质代谢
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