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皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究

作　者: 洪旭光
导　师: 孙修勤
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 皱纹盘鲍栉孔扇贝抗菌肽鲍防御素重组表达
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国黄渤海区的重要自然资源,也是我国北方的重要养殖品种。九十年代中期以来,病害频繁发生,造成的经济损失达百亿元,直接威胁到现有产业的生存。为了促进我国贝类养殖业的复兴和健康发展,实现我国蓝色农业的可持续化,海水养殖动物的免疫抗病机制成为最突出和亟待解决的问题。抗菌肽(antibacterial peptide)是基因编码的肽类抗菌分子,它们广泛存在于生物体内,是脊椎动物、无脊椎动物和植物的先天性免疫关键因子。长期以来,国内外对抗菌肽的研究主要集中在高等动物和一些低等昆虫方面,海洋抗菌肽研究是10年来发展起来的一个热点。本论文以我国重要海水养殖动物——栉孔扇贝和皱纹盘鲍为研究对象,开展抗菌肽的研究,取得了以下结果:(1)本文利用固相提取和HPLC技术,结合灵敏的酶标抗微生物活性检测法,从栉孔扇贝血液中纯化出1种抗菌肽。经测定其分子量为2000Da,部分氨基酸序列为GQPGHTGNAH……。(2)从作者所在实验室构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中,筛选得到了鲍防御素基因EST。通过序列分析,发现该基因cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成。该前体的成熟肽含42个氨基酸,推测分子量为4323Da、等电点为8.02。氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性最高、达到了70%。因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,作者认为该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,并将其命名为鲍防御素(hd-def)。(3)用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达,且鳗弧菌刺激引起的表达量比金黄色葡萄球菌诱导的高,说明该防御素基因属于诱导型表达。在被检测的5种组织中,hd-def基因仅在肝胰腺中表达,而在其它组织(性腺、鳃、肌肉和外套膜)中均未检测到表达。说明该基因具有明显的组织表达特异。人工感染刺激后,不同时间皱纹盘鲍的hd-def表达量有很大差异。感染早期(2hr)表达非常微弱,4hr时表达量明显增大,感染中晚期(12hr)表达量最大。该结果提示,hd-def基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染。(4)采用基因组步移法,获得了4032bp的全长基因组序列。分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497、2357和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中,这种是一种防御素基因的新结构模式,在其他昆虫防御素均未报道。(5)本文利用酵母表达系统,成功构建鲍hd-def基因的重组表达载体pPIC9k-hddef。重组酵母体外表达4.3kd蛋白,具有抗鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的活性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-43
  第一节抗菌肽的研究进展  11-28
    1.1 抗菌肽的基本特性  11
    1.2 抗菌肽的种类和结构  11-16
    1.3 抗菌肽生物学效应及机制研究  16-23
      1.3.1 对微生物等的直接杀灭或抑制作用  16-21
      1.3.2 抗菌肽的免疫防御作用  21-23
    1.4 抗菌肽基因的表达与调控  23-25
      1.4.1 基因定位  23
      1.4.2 基因调控与机制  23-25
    1.5 抗菌肽的开发与应用前景  25-28
      1.5.1 药物开发  25-26
      1.5.2 转基因生物和抗病品种培育  26-27
      1.5.3 保鲜剂和饲料添加剂  27-28
  第二节海洋抗菌肽研究进展  28-35
    2.1 海洋抗菌肽的种类与结构  28-31
    2.2 海洋抗菌肽的功能  31-32
    2.3 海洋抗菌肽的基因克隆  32-33
    2.4 抗菌肽的免疫防御与基因表达  33-34
    2.5 海洋抗菌肽的重组表达  34-35
  第三节毕赤酵母体外重组表达系统  35-40
    3.1 巴斯德毕赤酵母细胞的基本特性  36-38
    3.2 影响外源蛋白表达的因素  38-39
    3.3 毕赤酵母表达系统的应用与展望  39-40
  第四节研究目的、意义和内容  40-43
    4.1 鲍和扇贝的养殖现状与存在问题  40-42
      4.1.1 鲍  40-41
      4.1.2 扇贝  41-42
    4.2 研究意义和内容  42-43
第二章栉孔扇贝抗菌肽分离纯化  43-53
  1 材料与方法  44-45
    1.1 样品采集  44
    1.2 酸性提取  44
    1.3 固相提取（SPE）  44-45
    1.4 HPLC 纯化  45
    1.5 微生物检测  45
    1.6 测序  45
  2 结果  45-50
    2.1 诱导与粗提  45-46
    2.2 稻瘟真菌模型实验  46-47
    2.3 抗菌肽纯化  47-50
    2.4 序列测定  50
  3 讨论  50-53
第三章皱纹盘鲍防御素和基因表达  53-62
  第一节皱纹盘鲍防御素及cDNA 序列分析  53-57
    1.1 材料与方法  53-54
    1.2 结果  54-57
    1.3 讨论  57
  第二节皱纹盘鲍防御素基因表达  57-62
    2.1 材料与方法  57-60
      2.1.1 实验动物和试剂  57-58
      2.1.2 总RNA 的提取  58
      2.1.3 cDNA 合成  58-59
      2.1.4 半定量rt－PCR 扩增  59-60
    2.2 结果  60
    2.3 讨论  60-62
第四章皱纹盘鲍防御素（hd-def）的基因组克隆与结构分析..  62-77
  1 材料和方法  62-66
    1.1 实验动物与试剂  62
    1.2 基因组DNA 提取  62-63
    1.3 hd-def 编码区基因组克隆  63-64
    1.4 侧翼序列的基因组克隆  64
    1.5 PCR 扩增产物回收、转化、测序  64-66
    1.6 鲍防御素基因组结构分析  66
  2 结果  66-70
    2.1.h d-def 的基因组克隆  66-69
    2.2 鲍防御素基因组结构  69-70
  3 讨论  70-77
第五章皱纹盘鲍防御素重组表达  77-98
  1 材料和方法  77-91
    1.1 表达载体和培养基  77-81
    1.2 目的基因的获得  81-82
    1.3 过渡载体pPIC 9-hddef 的构建  82-84
      1.3.1 碱裂解法大量提取质粒pPIC9  82-83
      1.3.2 质粒pPIC9 的双酶切  83
      1.3.3 连接反应和转化  83-84
    1.4 表达载体pPIC9k-hddef 的构建  84-85
    1.5 毕赤酵母电转化和阳性转化子筛选  85-88
      1.5.1 重组表达质粒pPIc9k-hddef 的线性化  85
      1.5.2 重组表达质粒脱磷酸化处理  85-86
      1.5.3 感受态酵母制备  86-87
      1.5.4 电击转化  87
      1.5.5 毕赤酵母基因组提取和PCR 鉴定重组子  87-88
    1.6 重组酵母的诱导表达  88-89
    1.7 酵母表达外源蛋白质的SDS-PAGE  89-91
    1.8 重组表达产物的活性检测  91
  2 结果  91-95
    2.1 表达载体的构建  91-93
    2.2 转化与诱导表达  93-94
    2.3 生物学活性  94-95
  3 讨论  95-98
总结  98-99
参考文献  99-114
个人简历  114
博士论文期间发表和完成论文  114-116
致谢  116

皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究

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